蠋蝽组织蛋白酶基因鉴定及表达特征分析

组织蛋白酶在昆虫的消化、发育与变态中起重要作用,是捕食性蝽唾液(毒液)中普遍存在的成分,但其生理功能尚不清楚。本文利用同源比对的方法从蠋蝽Arma custos基因组中鉴定出组织蛋白酶基因,使用生物信息学软件分析其序列特征和进化关系,采用RT-PCR技术分析它们在成虫不同组织中的表达特征。结果表明,蠋蝽基因组中有37个组织蛋白酶基因,根据结构域分为组织蛋白酶B(AcCAB1-4)、组织蛋白酶D(AcCAD1-13)和组织蛋白酶L(AcCAL1-20)。多序列比对及结构域预测结果表明,组织蛋白酶B和组织蛋白酶L均含有Peptidase_C1结构域、保守的酶催化位点(谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺)以及1个由半胱氨酸残基(C)和组氨酸残基(H)构成的催化二联体,而组织蛋白酶D中存在保守Asp结构域和2个保守的酶催化位点(天冬氨酸)。RT-PCR结果显示,除AcCAL7和AcCAB2外,其余33个组织蛋白酶基因均在肠道中表达,且绝大多数表现特异性或高表达。AcCAL2、AcCAL5-7、AcCAL9等20个组织蛋白酶基因在唾液腺中表达,且AcCAL2仅在主腺后叶和副腺表达,AcCAL7仅在主腺前叶表达,AcCAD13仅在主腺后叶表达,AcCAB2仅在主腺前叶和主腺后叶表达。这些结果表明,多数组织蛋白酶基因在蠋蝽口外消化和肠道消化中发挥消化功能。

蠋蝽热激蛋白基因AcHsp83a和AcHsp83b的克隆、表达谱及对高低温和UV-B胁迫的响应

【目的】探索天敌昆虫蠋蝽Arma chinensis响应高低温和UV-B胁迫的分子机制。【方法】利用RT-PCR克隆蠋蝽热激蛋白基因Hsp83a和Hsp83b,并利用生物信息学分析其序列特征;利用RT-qPCR检测Hsp83a和Hsp83b在蠋蝽不同发育阶段(卵、1-5龄若虫、雌成虫和雄成虫)、成虫不同组织(头、胸、腹、翅、触角、脂肪体、足、马氏管、口器、中肠、卵巢和精巢)及38℃高温、4℃低温0(CK),6和24 h时和UV-B胁迫0(CK),6和12 h时雌成虫和雄成虫中的表达量。【结果】克隆获得蠋蝽2个Hsp90基因,分别命名为AcHsp83a(GenBank登录号:OP791883)和AcHsp83b(GenBank登录号:OP791884),开放阅读框(ORF)分别长2172和2163 bp,分别编码723和720个氨基酸,编码蛋白相对分子量分别为83.12和82.90 kD,等电点(pI)分别为4.94和4.97,C末端序列都含保守基序EEVD,均为胞质型热激蛋白。AcHsp83a和AcHsp83b高度保守。AcHsp83a在卵中表达量最高,AcHsp83b在成虫中表达量最高;AcHsp83a在雄成虫精巢中表达量最高,AcHsp83b在雌成虫中肠中表达量最高。对于雌成虫,随着38℃,4℃和UV-B处理时间的延长,AcHsp83a和AcHsp83b的表达量均先上升后下降,在6 h时达到最高。对于雄成虫,随着38℃和UV-B处理时间的延长,AcHsp83a的表达量均先上升后下降,在6 h时达到最高;随着4℃处理时间的延长,AcHsp83a的表达量在雄成虫中先下降后上升,在24 h时达到最高;在3种胁迫条件下,雄成虫体内AcHsp83b的表达量均较对照显著降低。【结论】蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b的差异表达说明其在蠋蝽的生长发育及适应极端温度和UV-B胁迫过程中发挥重要作用。

VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统检测亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌对阿米卡星的准确性评估

目的评价VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统（简称VITEK 2 Compact）检测亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌对阿米卡星药物敏感性试验结果的准确性,并了解其16S r RNA甲基化酶基因的存在情况。方法分别采用VITEK 2 Compact、纸片扩散法、E-test法检测72株临床分离的耐亚胺培南鲍曼不动杆菌和15株亚胺培南敏感的鲍曼不动杆菌对阿米卡星的敏感性,同时采用聚合酶链反应（PCR）检测其16S r RNA甲基化酶arm A基因。结果在72株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌中,纸片扩散法和E-test法的结果均一致;有69株细菌VITEK 2 Compact检测最低抑菌浓度（MIC）为4~≥64μg/m L,而纸片扩散法和E-test法结果均为耐药;有3株细菌VITEK 2 Compact检测MIC为≤2μg/m L,纸片扩散法和E-test法有2株敏感;有59株细菌出现双圈耐药现象。在纸片扩散法及E-test法检测为阿米卡星耐药的70株鲍曼不动杆菌中,arm A基因阳性率为92.9%（65/70）。15株亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌中,VITEK 2 Compact对阿米卡星的MIC均≤2μg/m L,纸片扩散法和E-test法的阿米卡星药物敏感性试验结果与VITEK 2 Compact一致,均为敏感。结论 VITEK 2 Compact在检测耐亚胺培南鲍曼不动杆菌对阿米卡星的敏感性时会出现不准确的结果,双圈耐药现象可能与携带16S r RNA甲基化酶基因arm A有关。

多重耐药鲍曼不动杆菌中16SrRNA甲基化酶基因的检测及耐药分析

目的了解医院分离的多重耐药鲍曼不动杆菌16SrRNA甲基化酶基因分布情况,为临床合理应用抗菌药物提供依据。方法采用Phoenix100微生物全自动鉴定系统进行菌株鉴定及药敏试验;采用PCR方法检测armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因。结果 46株鲍曼不动杆菌中armA基因阳性36株,阳性率78.3%,未检出rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因。药敏试验结果显示医院分离的多重耐药鲍曼不动杆菌对多黏菌素全部敏感,对四环素、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药率分别为13.0%、80.4%、91.3%、95.7%、95.7%,对其他测试药物耐药率100%。结论医院分离鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药性已非常严重,携带armA基因是导致氨基糖苷类耐药的原因之一,延缓鲍曼不动杆菌多重耐药性已刻不容缓。

鲍曼不动杆菌临床株中可移动遗传元件ISCR1的作用

目的了解鲍曼不动杆菌临床株中新型可移动遗传元件ISCR1的携带情况及其下游基因环境,探讨鲍曼不动杆菌耐药播散机理。方法收集多重耐药鲍曼不动杆菌临床株34株和敏感株21株,PCR扩增ISCR1基因及其下游的基因环境,扩增产物测序分析。结果 34株多重耐药鲍曼不动杆菌临床株中,携带ISCR1基因14株,其中11株ISCR1阳性多重耐药株,在ISCR1基因下游携带氨基糖甙类耐药基因armA基因;21株敏感株中,ISCR1基因扩增结果均为阴性。结论 ISCR1元件可能参与了armA耐药基因的水平播散。

导致阿米卡星双圈耐药肠杆菌科细菌耐药性研究

目的探讨临床分离的纸片扩散法药物敏感性试验对阿米卡星(AMK)呈双圈耐药的肠杆菌科细菌相关携带基因及药物诱导对耐药基因mRNA表达量的影响。方法收集纸片扩散法药物敏感性试验对AMK呈双圈耐药的大肠埃希菌(编号Eco85)和肺炎克雷伯菌(编号Kpn110)各1株;纸片诱导法探讨耐药表型的改变;聚合酶链反应(PCR)扩增氨基糖苷类修饰酶基因、整合子及其可变区以及16S rRNA甲基化酶基因;逆转录PCR分析armA基因在AMK诱导前后菌株中的表达情况;接合试验探讨耐药基因的可传递性。结果 Eco85和Kpn110分别在第10代和第16代诱导后转变为双圈消失;2株菌均扩增出Ⅰ类整合子基因,可变区分别携带aadA5-dfra17和aadA2-dfrA12基因盒,未扩增出Ⅱ和Ⅲ类整合子基因;Eco85扩增出aac(6)-Ⅰ基因,而Kpn110扩增出ant(3″)-Ⅰ基因;Eco85和Kpn110均扩增出armA基因,基因测序未发现突变,未检出rmtB基因;经AMK诱导后菌株armA基因mRNA表达量明显上升;接合试验未获成功。结论大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对AMK呈双圈耐药可能与16S rRNA甲基化酶armA基因的诱导表达相关。

广泛耐药铜绿假单胞菌甲基化酶基因的检测和基因周边结构分析

目的了解16S rRNA甲基化酶基因在广泛耐药(XDR)铜绿假单胞菌临床株中的分布及此类耐药基因周边结构。方法收集XDR铜绿假单胞菌59株,琼脂稀释法测定MIC,PCR方法检测16S rRNA甲基化酶基因(armA,rmt A,rmtB,rmtC,rmtD,rmtE,npmA),ERIC-PCR方法进行同源性分析,并对检出的16S rRNA甲基化酶基因armA和rmtB进行周边序列分析。结果 59株XDR铜绿假单胞菌临床分离株中,16S rRNA甲基化酶基因总检出率62.7%(37/59),rmtB的检出率略高于armA,未检出其他甲基化酶基因。根据ERIC-PCR结果受试临床株可分为19个型别。17株检出armA基因菌株分布在3个克隆,其中15株(88.2%)集中在一个克隆(克隆D);而rmtB基因散布于9个克隆。基因周边序列分析显示,armA基因位于一个含多种转座酶的移动元件上,其与大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌携带的armA阳性质粒序列一致性达99%;rmtB基因也位于一个含转座酶的移动元件上,其与大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌携带的rmtB质粒序列高度一致。结论 16S rRNA甲基化酶基因在XDR铜绿假单胞菌分离株中分布广泛,均在对庆大霉素高度耐药的菌株中检出。armA在铜绿假单胞菌中存在克隆传播。

鲍曼不动杆菌armA基因的分布与耐药性的研究

目的调查我院鲍曼不动杆菌中16S rRNA甲基化基因armA的分布以及与鲍曼不动杆菌耐药谱的关系，并初步探讨其在分子流行病学分析中的作用。方法收集72株鲍曼不动杆菌，采用K-B法对鲍曼不动杆菌进行药物敏感试验，后采用PCR筛选鲍曼不动杆菌的16S rRNA甲基化基因。armA，并利用随机扩增多态性DNA法（RAPD）技术进行基因分型。统计各鲍曼不动杆菌菌株对多种氨基糖苷类药物的药敏结果，并分析基因型与耐药性的关系。结果根据PCR产物片段大小，72株鲍曼不动杆菌共有armA基因阳性菌株20株（27．8％）。含有armA基因型鲍曼不动杆菌菌株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐药率均为90％；随机扩增多态性DNA法显示20株armA基因阳性的鲍曼不动杆菌主要分为7型，A型为优势克隆株。结论产16S rRNA甲基化基因armA的鲍曼不动杆菌菌株可对多种氨基糖苷类抗生素高水平耐药。同一克隆菌株在病房内和病房间的传播为我院armA以基因传播的主要方式。

氨基糖苷类药物耐药基因armA实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的建立一种快速、准确检测细菌中arm A耐药基因的Taq Man实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。方法根据arm A基因设计特异的引物及探针,在多种常见致病菌中检测其特异性;使用阳性质粒标准品评价该方法的灵敏度;使用粪便模拟标本验证该方法的应用性。结果本方法特异性好,建立的arm A耐药基因real-time PCR方法标准曲线,确定其对质粒标准品的灵敏度为4.07×101拷贝/ml。应用该方法对粪便模拟标本进行检测,其检测下限为1.3×104cfu/ml。结论本研究建立了arm A耐药基因荧光定量PCR检测方法,有望在耐药基因监测中推广使用。

携带armA基因的铜绿假单胞菌耐药性及基因周边环境

目的了解多重耐药(MDR)铜绿假单胞菌armA基因与可移动遗传元件的携带情况及其相关性;分析armA基因的周边环境,探讨armA基因转移的可能机制。方法收集MDR铜绿假单胞菌98株,琼脂稀释法测定MIC,PCR方法检测16S rRNA甲基化酶基因armA、I型整合子、可移动元件IS26及重要耐药基因侧翼基因环境,测序并拼接PCR产物明确耐药基因座位排列,并对armA基因进行周边序列分析。结果98株MDR铜绿假单胞菌检出5株armA基因PCR扩增阳性,携带armA基因的菌株对庆大霉素和阿米卡星全耐药;检出20株携带I型整合子,17株携带可移动元件IS26;armA基因扩增阳性的菌株均携带I型整合子和IS26;序列测序显示armA定位于Tn1548相关区域,位于插入序列ISCR1的下游,该序列含多种移动元件。结论大连市氨基糖苷类高水平耐药基因armA广泛分布在MDR铜绿假单胞菌中,均对庆大霉素和阿米卡星高度耐药;该基因定位在转座子Tn1548的质粒上,提示16S rRNA甲基化酶基因armA的广泛播散可能是可移动元件ISCR1-armA-IS26结构参与其中。

阴沟肠杆菌临床分离株armA基因分布与分子分型研究

目的调查某医院阴沟肠杆菌临床分离株的耐药性和arm A基因分布情况,探索arm A阳性菌株与耐药性的关系及其分子分型特征。方法采用微量肉汤稀释法对51株临床分离的阴沟肠杆菌进行药敏试验;荧光定量PCR方法检测16S rRNA甲基化基因arm A;脉冲场凝胶电泳试验(PFGE)分析arm A阳性菌株间的亲缘关系。结果阴沟肠杆菌临床分离株对阿米卡星和庆大霉素的耐药率分别为39.2%和54.9%,arm A基因阳性率为23.5%,arm A阳性菌株对阿米卡星和庆大霉素均耐药;12株携带arm A基因菌株主要分为5型,无明显优势菌株。结论产16S rRNA甲基化酶arm A的阴沟肠杆菌菌株对氨基糖苷类药物耐药,应加强对该基因监测,合理指导临床抗生素应用。

铜绿假单胞菌耐药性与16S rRNA甲基化酶表达分析

目的了解医院铜绿假单胞菌(PAE)中16S rRNA甲基化酶表达情况及与耐药关系。方法用K-B纸片法进行药敏试验,采用聚合酶链反应(PCR)扩增68株铜绿假单胞菌16S rRNA甲基化酶armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA基因。结果 68株铜绿假单胞菌对阿米卡星、庆大霉素、头孢他啶及磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药率分别为51.5%、67.6%、63.2%和78.0%,呈高水平耐药,而对链霉素仍具有一定的敏感性,armA、rmtB和rmtC的检出率分别为5.9%、29.4%及2.9%,未检出rmtA、rmtD和npmA基因,其中16S rRNA甲基化酶阳性株对阿米卡星和庆大霉素的耐药达到100.0%。结论铜绿假单胞菌多药耐药可能与16S rRNA甲基化酶表达情况有关,在PAE 16S rRNA甲基化酶中检出rmtC基因,加强对耐药菌株的检测,严格按药敏结果用药及通过交替换药等方式有助于减少或延缓PAE耐药菌株的传播与流行。

鸡沙门菌16S rRNA甲基化酶的检测及扩散机制

为了解鸡沙门菌16S rRNA甲基化酶基因(armA,rmtA,rmtB,rmtC,rmtD,rmtE和npmA)的扩散机制,在分离鉴定沙门菌的基础上,分别进行药敏试验、耐药基因检测、质粒接合及电转化、质粒分型、Southern blot以及耐药基因遗传环境分析等。结果显示,在分离的21株沙门菌中,只有1株对阿米卡星和庆大霉素高度耐药,且armA基因阳性。多次尝试进行质粒接合试验均未获成功,但质粒转化试验成功获得了转化子。质粒分型和Southern blot证实armA位于IncFⅡ质粒上。armA基因的遗传背景分析表明,该基因位于一个两端具有插入序列IS26的复合转座子上。本研究在动物源沙门菌检测到16SrRNA甲基化酶基因armA,且证实armA基因位于IncFⅡ质粒的复合转座子上,提示转座子和质粒均可在armA基因的水平扩散中发挥重要作用。

广泛耐药肺炎克雷伯菌16S rRNA甲基化酶基因的检测

目的 检测临床分离的广泛耐药肺炎克雷伯菌菌株的16S rRNA甲基化酶基因。方法 2019年2月—2020年12月延安大学附属医院分离的广泛耐药肺炎克雷伯菌59株,行菌株对4种抗生素的药敏试验,用PCR方法检测6种16S rRNA甲基化酶基因。结果 肺炎克雷伯菌对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、奈替米星的耐药率分别为88.14%、98.31%、89.83%、91.53%,对庆大霉素的耐药率高于阿米卡星、奈替米星,差异有统计学意义(P<0.05)。16S rRNA甲基化酶基因检出率为66.10%,其中armA、rmtB基因检出率分别为23.73%、42.37%,未检出其他4种甲基化酶基因。结论16S rRNA甲基化酶基因在耐药肺炎克雷伯菌分离株中广泛分布,以armA、rmtB基因为主。