Conservation and reintroduction of the rare and endangered orchid Paphiopedilum armeniacum

Paphiopedilum armeniacum is a rare and endangered lady’s slipper orchid in China.It is distributed around the mid-elevations of the Nu Mountains in southwest China.Due to over-harvest,habitat loss,and degradation,wild populations of P.armeniacum has declined drastically.A combination of approaches involving biotechnology,habitat restoration,and interspecific relationship reconstruction was used to carry out the reintroduction of the species.Integrated conservation program for this species included in-situ protection,ex-situ conservation,and reintroduction,which helped to rebuild a harmonious relationship between local farmers and P.armeniacum.The sustainable utilization of native plant resources in poor areas can promote regional sustainable development which is compatible with species protection.

葡萄风信子MaMYB114基因克隆及功能研究

MYB转录因子在植物花青素生物合成过程中发挥主要调控作用。为探究MYB转录因子在葡萄风信子(Muscari spp.)蓝色花色形成中的作用,研究以葡萄风信子‘亚美尼亚’为试验材料,基于课题组前期转录组数据库深度挖掘,经本地Blast比对分析,采用RT-PCR方法克隆获得1个R2R3-MYB基因,命名为MaMYB114(GenBank登录号:OQ615377),对其进行生物信息学分析和异源转化烟草功能验证。结果表明,(1)MaMYB114开放阅读框全长为714 bp,编码237个氨基酸;MaMYB114蛋白含有R2R3保守结构域,属于R2R3-MYB家族AN2亚家族。(2)亚细胞定位及转录自激活结果显示基因定位于细胞核,且具有转录自激活活性,符合转录因子一般特征。(3)实时荧光定量分析显示MaMYB114基因主要在花中高表达,表达模式具有组织特异性。结合不同时期花青苷含量变化模式,发现MaMYB114在着色期花青素含量高的花蕾中高表达,表明MaMYB114可能参与了葡萄风信子花青苷合成过程。(4)过表达MaMYB114促进烟草花青苷积累,表明MaMYB114正向调控花青素合成。本研究表明,MaMYB114基因可能是参与葡萄风信子蓝色花色形成的重要调控基因。

濒危物种杏黄兜兰的保育生态学

杏黄兜兰(Paphiopedilum armeniacum)是中国特有的兰科濒危物种。自2000年4月1日至2005年10月10日,在云南省怒山的落砂坡山选取66个调查点进行杏黄兜兰保育生态学研究:对443基株共1302分株进行了繁殖式样、物候和生命周期等主要生物学特性,以及对该物种的生境要求、群落结构特征等生态学习性进行了观察研究,并在广东省深圳进行迁地保护和迁地繁殖后重返原产地的试验,研究了原产地的气候、植被和其他环境因素与杏黄兜兰之间的关系以及杏黄兜兰迁地栽培和繁殖的无性后代重返原生长地的生物学特性。研究结果表明:落砂坡山的杏黄兜兰在石灰岩上的次生灌木丛或草丛内生长良好;它兼具有性和无性繁殖,无性繁殖的目的就是实现有性繁殖和延长基株的寿命;无性繁殖有二种形式:产生分蘖或根茎;灌木丛或草丛的落叶为杏黄兜兰生长提供腐殖质,杏黄兜兰根茎繁殖是它对落叶等覆盖的一种适应;分株的开花率为7.39%±1.02%,开花分株的结果率为32.23%±12.08%;杏黄兜兰具有入侵适度破坏和正处于恢复初期的森林环境的能力,而在茂密连片的大树森林内不能生长。杏黄兜兰在深圳人工疏林下生长良好并繁殖许多无性的克隆分株,将繁殖的克隆分株重返原产地能正常开花和结实。试验结果显示,杏黄兜兰可以进行迁地保护以保存种质资源和迁地繁殖的植株回归原产地。基于杏黄兜兰濒危机制的分析,认为,杏黄兜兰生存所面临的威胁是生长空间被完全剥夺和人为灭绝性采集而不是其自身存在的生物学缺陷,为此,提出了相应的保育对策。

杏黄兜兰和硬叶兜兰的种子试管培养

杏黄兜兰(Paphiopedilum armeniacum)和硬叶兜兰(P.micranthum)受粉后120 d和180 d的种子接种到1/4 MS,MS,R,KC,VW和花宝1号培养基上进行试管培养。低盐浓度的培养基较适宜兜兰种子萌发,R培养基效果最好,萌发率可达30％以上;果荚采收的时间对种子萌发有重要的影响;添加200 mL·L-1的椰子乳可促进种子萌发。育苗培养基中添加活性炭2 mg·L-1和香蕉匀浆100 g·L-1有利于种子苗生长。

葡萄风信子器官和体胚发生的解剖及生理特性研究

以葡萄风信子"蓝穗"叶片为材料,分别对器官发生和体胚胎发生过程中不同时期超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶活性(POD)、可溶性糖和可溶性蛋白质含量进行测定,并对2种途径中的典型时期进行解剖结构观察。结果表明:抗氧化酶类活性、可溶性糖和蛋白质含量与植物细胞形态发生密切相关;在不定芽分化和体胚发生初期,胚性愈伤的POD、SOD活性与可溶性蛋白质含量显著高于非胚性愈伤组织。此外,器官发生和体胚发生途径差异在愈伤组织形成期已开始产生,说明该期是器官和体细胞胚发生关键的调控时期。因而可通过向培养体系中加入不同激素、糖或蛋白等物质,进而调节植物细胞生理代谢方向,达到影响培养物形态发生的目的。

秋水仙素诱导葡萄风信子多倍体的研究

在离体培养条件下,比较了秋水仙素不同质量分数、不同处理时间诱导亚美尼亚葡萄风信子体细胞染色体加倍的效果。利用秋水仙素混配和浸泡法对亚美尼亚葡萄风信子的染色体进行加倍诱导,采用染色体常规压片法鉴定染色体数目。结果表明,浸泡法以秋水仙素质量分数为0.05%,时间为15 h的变异率最高,达到45.6%;混培法以秋水仙素质量分数为0.05%,时间为15 d的变异率最高,为21.1%。经秋水仙素诱导的变异株与正常二倍体植株比较,诱变植株叶片变厚变宽,叶色变深,鳞茎变大,气孔显著增大而单位面积气孔数减少,对诱变植株进行细胞学观察后发现,对照二倍体植株2n=2x=18,变异株2n=4x=36,为四倍体,另外还发现嵌合体的存在。

葡萄风信子体细胞胚再生体系的建立及抗生素敏感性试验

【目的】建立葡萄风信子体细胞胚再生体系,通过外部形态判断愈伤组织的类型,并探索胚性愈伤组织对头孢霉素和潮霉素的敏感性。【方法】以多年生葡萄风信子‘蓝穗’的盛花期叶片为试验材料,通过正交试验筛选胚性愈伤组织诱导时适宜的植物生长调节剂质量浓度及配比;石蜡切片法观察不同愈伤组织内部的细胞结构,诱导具有胚性的愈伤组织形成体细胞胚,进而获得再生植株;在培养基中加入头孢霉素或潮霉素,观察2种抗生素对胚性愈伤组织生长和体细胞胚发生的影响。【结果】葡萄风信子胚性愈伤组织诱导的适宜培养基为MS+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L TDZ,在该培养基上诱导率高达100%。石蜡切片观察发现,外观质地紧密、节状或块状的愈伤组织为胚性愈伤组织。胚性愈伤组织在不含任何激素的MS培养基上可诱导形成体细胞胚,在光照条件下体细胞胚伸长并生根,最后形成成熟小鳞茎。头孢霉素质量浓度超过500mg/L时,葡萄风信子胚性愈伤组织的生长和体细胞胚的发生受到强烈抑制;引起胚性愈伤组织褐变的潮霉素临界质量浓度为90mg/L。【结论】建立了葡萄风信子体细胞胚再生体系,90mg/L潮霉素可作为区分转化与非转化葡萄风信子胚性愈伤组织的有效选择压。

杏黄兜兰菌根研究与应用

采用根组织切片法从杏黄兜兰根内分离到 1 3株真菌 ,镰刀菌和组丝核菌为优势菌。将组丝核菌JF74、JF75、JF80制成菌剂 ,施入杏黄兜兰根部 ,对杏黄兜兰产生了一定的促进生长的效果。

葡萄风信子MaFLS基因克隆与表达分析

该研究利用PCR技术从葡萄风信子‘亚美尼亚’中克隆了1个黄酮醇合成酶(FLS)基因,命名为MaFLS。MaFLS的cDNA全长为1 076bp,开放阅读框为999bp,编码332个氨基酸,推测的蛋白质分子量38.51kD,理论等电点为5.09。同源比对和系统进化分析表明,MaFLS基因编码的氨基酸具有黄酮醇合成酶典型的2-ODD超家族保守结构域,与拟南芥和高粱FLS一致性分别为60%和83%。半定量PCR和荧光实时定量PCR表达分析表明,MaFLS在花器官中高表达,在根、茎、叶中微量表达,在完全未着色的花蕾期开始表达并于花完全开放未着色时期到达峰值,之后随花发育表达量逐渐降低。原核表达检测到1条大约38kD的外源蛋白,与预测的蛋白分子量相符。该研究结果为进一步探讨葡萄风信子MaFLS基因对黄酮类物质合成的调控作用奠定了基础。

葡萄风信子转录因子MaMYB2的克隆及表达模式分析

试验从葡萄风信子"亚美尼亚"中利用RACE技术克隆了一个MYB类转录因子,命名为MaMYB2,Genebank登陆号为KJ744038。克隆到的MaMYB2全长711bp,开放阅读框为600bp,编码199个氨基酸,推测的蛋白分子量约为22.34ku,理论等电点为5.46,保守域具有DNA结合位点;与矮牵牛(AAF66730.1)关系最近;核定位试验表明MaMYB2蛋白定位在细胞核中;实时定量PCR分析了MaMYB2在葡萄风信子"亚美尼亚"不同组织部位中的表达模式,结果不同组织中均有表达,在花中表达量最高,且随着花色变深表达量逐渐升高。结果表明,MaMYB2有可能参与了葡萄风信子中花青素积累的转录调控。

影响杏黄兜兰种子萌发的因素

通过在不同条件下杏黄兜兰 (Paphiopedilumarmeniacum)种子萌发的观察 ,对影响其萌发的诸因子报道如下 :1)果实的生长期与种子的萌发率有关。实验表明种子采自生长期为 6 0d的果实 ,发芽率为 3 5 % ,采自 12 0d的果实 ,发芽率为 4 0 % ,采自 180d的果实 ,发芽率为 18 3%。 2 )培养基也会影响到种子的萌发 ,种子在 1 5MS内培养 ,萌发率明显高于培养于MS ,RE和改良HyponexNo 1内的种子。 3)培养基 (1 5MS)掺入添加物也会影响到种子的萌发率 ,如掺入 10 %椰子水会促使种子的萌发率达到很高的水平 ,掺入马铃薯泥 (5 0g L)或胰化胨 (2g L) ,种子的萌发率会达到较高的水平 ,而掺入香蕉泥则会对种子的萌发率产生负面影响 ,掺入活性炭 (2g L)会促使种子萌发和幼苗发育。 4 )与固态培养基相比 ,种子在液体悬浮培养基内的萌发速度更快 ,幼苗更为整齐划一。

葡萄风信子谷胱甘肽S转移酶基因克隆与表达分析

以亚美尼亚葡萄风信子为材料,利用本课题组前期获得的葡萄风信子转录组数据库,根据已经获得的葡萄风信子GST基因片段,通过PCR技术克隆得到葡萄风信子GST基因的c DNA序列,命名为Ma GST。Ma GST的c DNA全长为711 bp,开放阅读框为666 bp,编码221个氨基酸,推测蛋白质分子量为54.1 k D,理论等电点p I为5.13。利用生物信息分析软件对Ma GST基因进行同源性比对和系统进化分析表明,结果显示该基因编码的氨基酸具有谷胱甘肽S转移酶典型的C端与N端双结构域,属于GST Tau家族蛋白;与洋葱和小麦GST基因的一致性分别为76.72%和62.50%。实时定量PCR结果显示Ma GST在葡萄风信子各组织器官表达强度相似,属于组成型表达;水杨酸(SA)可以明显诱导Ma GST表达,Ma GST对氯化钠(Na Cl)应答不是很明显,甚至表达量有稍微的下调。

濒危物种杏黄兜兰分布区种子植物区系分析

在云南省泸水县杏黄兜兰分布区进行种子植物区系成分调查,并以此为基础,研究杏黄兜兰分布区种子植物区系组成及其特征,结果表明:在调查区域内,共有种子植物38科68属78种;其中以兰科和壳斗科植物种数最多(7种),分别占该分布区种子植物总种数的8.97%,其次为菊科(6.41%)。群落中单种科、寡种科、单种属及寡种属占有很高的比例。杏黄兜兰分布区内植物区系的地理成分复杂;各类热带分布区类型属的数量占调查区域内总属数的33.82%,各类温带分布类型属的数量占调查区域内总属数的52.94%,表明杏黄兜兰分布区内的种子植物区系具有明显的热带向温带过渡的性质;世界广布、东亚(热带、亚热带)及热带南美间断分布、北温带广布对杏黄兜兰群落种子植物区系性质影响极大。

七种兜兰属植物的形态变异式样研究

本研究选择杏黄兜兰及其7个近缘种,从形态性状水平分析了它们的形态变异式样.本研究中的7种兜兰属植物不同形态变异以及形态总体变异在物种水平表现出如此规律:在同一物种内,营养器官性状变异程度比生殖器官性大;同一性状在7个种间变异幅度基本接近,种间形态总体差异都不显著,不同种间,同一性状变异幅度基本相同.表明它们对环境适应能力不强,生存力较弱.这可能是它们珍稀额危的原因之一.7种兜兰植物的性状可能主要由遗传因子决定,尽管外界条件有很大影响,但只在一定程度上起修饰作用.花部性状的变异性往往小于营养性状的变异性.

杏黄兜兰和硬叶兜兰在北京的催花比较试验

为确保2011年春节兰展期间能够将从贵州引种的杏黄兜兰和硬叶兜兰及时展出,在春节前对这两种兜兰进行引种催花比较试验。结果表明:(1)杏黄兜兰更适宜换基质栽培,硬叶兜兰是否换基质对其花芽率的影响不大。(2)硬叶兜兰更适宜在11月引种并做低温处理,如果在9月引种也适宜做低温处理;杏黄兜兰对引种的月份要求不高,两个月份引种都不适宜做低温处理。(3)高温温室的催花时间应在春节布展前2～3个月较合适,大约在11月。

珍稀濒危植物杏黄兜兰的生境调查和栽培试验

2005年对野生的杏黄兜兰进行了温室栽培试验,并于2006年4月用典型抽样法对杏黄兜兰的生境进行了调查研究。杏黄兜兰天然分布集中在怒江流域,垂直分布范围超过现有资料记载的海拔2100 m。杏黄兜兰分布区为典型的亚热带山地气候,在以石灰岩为基质发育的土壤上,杏黄兜兰丛生于高山栎-杜鹃次生灌木群落内腐殖质丰富的林下,杏黄兜兰易栽培成活。不同遮荫和施肥处理的杏黄兜兰的叶绿素含量差异不显著,但存在随着遮荫强度增加而增加的变化趋势;不遮荫和单层遮荫处理下,叶绿素含量随着N肥中的含N量增加而增加;不同遮荫和施肥处理对杏黄兜兰的叶片长度和叶片宽度影响不大,但不同遮荫强度对杏黄兜兰叶片的厚度有较大影响。

葡萄风信子MaANS基因及启动子的克隆与分析

该研究根据转录组测序结果,在葡萄风信子（Muscari armeniacum）‘亚美尼亚’中克隆到花青素合酶（ANS）基因的cDNA与DNA序列,该基因命名为MaANS。采用荧光实时定量分析MaANS时空表达模型,同时利用染色体步移法克隆到MaANS上游1 044bp的一段序列。信息学分析表明：MaANS开放阅读框为1 065bp,编码355个氨基酸;DNA与cDNA的一致性为89.62%,DNA序列在ATG下游515~594bp之间插入1个79bp内含子;启动子序列在-70bp位置有1个TATA-box,有多个光响应元件及MYB结合位点等。荧光实时定量分析表明,MaANS基因在花中优势表达,并且在完全着色期表达量最高。该研究结果为深入研究MaANS基因功能、分析葡萄风信子着色机理奠定了基础。

濒危植物杏黄兜兰环境因子监测设计

【目的】实时了解杏黄兜兰所在生存环境的各项参数,掌握其最佳生长环境,为进一步实时控制其环境参数,促进物种的繁殖生长,防止物种的濒危灭绝,保护生态环境提供参考。【方法】运用AT89C51单片机为控制处理核心,以杏黄兜兰生长环境的温度、湿度、光照强度为监测参数,选用DS18B20温度传感器、HS1101湿度传感器、TSL235光频转换器进行数据采集,并采用PTR2000模块实现短距离无线传输。【结果】AT89C51单片机可实现对温度、湿度、光照强度等多个环境因子的共同监测,将环境因子值显示于数码管,传输距离可达300m。【结论】设计方案适用于杏黄兜兰所生长的云南福贡、碧江、泸水等地区的环境监测,其传感器选型符合当地特殊的环境要求,数据采集及传输方式合理有效,可以实现室外条件下多个环境因子的共同监测和无线传输。

葡萄风信子外植体直接再分化花芽和营养芽的研究

【目的】探索葡萄风信子直接再生花芽体系的建立,为葡萄风信子外植体直接再分化花芽研究提供参考。【方法】以葡萄风信子‘亚美尼亚’花蕾外植体为材料,MS为基础培养基,在均添加0.1mg/L 2,4-D的条件下,分别用不同质量浓度的6-BA(0,0.5,1,2,3,4mg/L)、GA3(0,0.5,1,2,3,4mg/L)和玉米素(0,0.05,0.1,0.5,1,2mg/L)处理,筛选出诱导花芽的最佳激素及最适质量浓度;以MS+6-BA(或玉米素)2mg/L+2,4-D 0.1mg/L研究开花时花瓣切片、花葶、叶片以及叶片诱导的愈伤组织诱导直接再分化花芽的情况。【结果】用MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D处理葡萄风信子花蕾时,可在花蕾基部直接再分化出具有蓝色的花芽,且花芽分化率最高,达60.2%。花葶、花瓣切片、叶片和愈伤组织在同样条件下只能诱导产生愈伤组织、营养芽。说明花蕾是诱导花芽分化的最佳外植体,且最适培养基为MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D。【结论】建立了葡萄风信子外植体直接再分化花芽体系。

葡萄风信子MaHY5基因的克隆与表达分析

HY5(ELONGATED HYPOCOTYL5)是促进植物光形态建成过程中非常重要的转录因子。该研究以亚美尼亚葡萄风信子( Muscari armeniacum )为材料,克隆出1个bZIP型转录因子基因 MaHY 5(GenBank 登录号MK281355)。生物信息学分析显示, MaHY 5基因开放阅读框为438 bp,编码145个氨基酸,蛋白质分子量约为16.1 kD,理论等电点为9.78,含有一个保守的bZIP特征结构域;MaHY5蛋白属于亲水性蛋白,无信号肽结构,属于非分泌蛋白,可能定位于细胞核。序列比对和进化树分析表明,HY5在进化过程中高度保守。实时荧光定量PCR和高效液相色谱检测分析表明, MaHY 5基因的表达与花青素积累模式基本协同,都在花中优势表达,且在完全开放的花朵中表达较高。推测 MaHY 5基因可能参与了葡萄风信子花色素积累过程。