耐高浓度As(Ⅲ)菌株的16S rDNA鉴定及对其As(Ⅲ)氧化酶性质的研究

对从某研究所含砷废水中分离筛选得到的一株耐高浓度As(Ⅲ)且能氧化As(Ⅲ)的菌株(AS-01)进行16 S-rDNA基因序列相似性分析,将该菌株鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。该菌28 h内对As(Ⅲ)的氧化率达29.8%。对该菌亚砷酸盐氧化酶的酶学性质初步研究表明,该氧化酶的最适宜作用温度为30℃,最适宜pH为6.0,且为亚砷酸盐诱导型酶。

三价砷氧化细菌Acidovorax sp.GW2中As(Ⅲ)氧化酶基因和调控序列的克隆鉴定

通过反向PCR和细菌Fosmid文库筛选,克隆得到1株三价砷[As(Ⅲ)]氧化细菌Acidovorax sp.GW2的As(Ⅲ)氧化酶Aox基因簇,包括aoxRSXABCD7个基因,分别预测编码双组分信号传导系统转录调控子AoxR(同源性68%),周质感应组氨酸激酶AoxS(同源性55%),周质结合蛋白AoxX(同源性55%),砷氧化酶AoxAB(同源性分别为74%和71%),硝基还原酶AoxC(同源性46%),细胞色素c AoxD(同源性63%)。反转录PCR结果显示,编码双组分系统的aoxRS基因共转录,而与之转录方向相反的结构基因aoxABCD处于同一操纵子中,aoxX基因和aoxRS基因不在同一操纵子中。通过对aoxS、aoxX、aoxD的基因敲除功能研究发现aoxS和aoxX基因为GW2三价砷氧化的必需基因,aoxD的功能丧失减慢了三价砷的氧化速率,但非关键基因。

亚砷酸氧化菌Sinorhizobium sp. GW3的鉴定与亚砷酸氧化酶基因的分离

亚砷酸氧化细菌能够将毒性大的As(Ⅲ)氧化成毒性小的As(Ⅴ),在生物修复砷污染方面具有应用价值。对一株新型亚砷酸氧化菌Sinorhizobium sp.GW3进行了较全面的鉴定,并分离及分析了亚砷酸氧化酶基因aoxAB。形态学、生理生化鉴定和16S rRNA基因等分析结果表明该菌为Sinorhizobium属。该菌对As(III)抗性的MIC(Minimum inhibitory concentration)为9 mmol/L。首次在Sinorhizobium属中分离了包括编码小亚基aoxA和大亚基aoxB在内的亚砷酸氧化酶基因,其编码的大小亚基与已发现的Agrobacterium tumefaciens(ABB51929)的大小亚基在氨基酸水平上分别有86%、80%的同源性。

Bacillus sp.C62的砷氧化功能及亚砷酸盐氧化酶活力测定

微生物对于降低环境中的砷毒性具有重要作用。从高砷土壤中筛选出耐砷菌株C62,通过生理生化特征和16SrRNA基因序列同源性分析对其进行分类鉴定;采用原子荧光光谱法和亚砷酸盐氧化酶大亚基(aoxB)基因序列分析法验证菌株C62的砷氧化功能;优化菌株C62亚砷酸盐氧化酶(Aro)活力的测定条件,并对提取的粗酶进行酶活力测定,以为后续的分离纯化以及微生物处理砷污染的实际应用奠定理论基础。结果表明:菌株C62是一株砷氧化细菌,属于芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp.C62,可在28h内将培养基中5mmol/L的As(III)氧化为As(V);菌株C62亚砷酸盐氧化酶(Aro)基因的表达需要As(III)的诱导;利用连续监测法采用优化后的测定条件,测得Bacillus sp.C62的粗酶活力为0.015μmol DCIP/(min·mg),与文献中已报道的几种Aro的活力接近。

耐As(Ⅲ)及高效氧化As(Ⅲ)基因工程菌的构建

As(Ⅲ)氧化酶能够催化氧化As(Ⅲ),将水体中的As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ)后,毒性将大大降低且易脱除.通过聚合酶链反应(PCR)从能高效氧化As(Ⅲ)的嗜热栖热菌株(Thermus therm ophilusHB8)质粒pTT27扩增了三价砷氧化酶基因(TTHB127,TTHB128),将TTHB127、TTHB128分别定向克隆到pBBR1MCS-5载体上,构建重组质粒127pBBR128,通过三亲杂交,在辅助质粒pRK2013的帮助下,将质粒127pBBR128转移到耐性菌AS-01中,得到的工程菌127pBBR128-AS具有As(Ⅲ)的耐受性和高氧化性的功能,且127pBBR128-AS的As(Ⅲ)氧化酶活力是出发菌株AS-01的8倍.

1株厌氧砷氧化菌的分离鉴定及砷氧化特性研究

三价砷(As(Ⅲ))氧化细菌能够将毒性大的As(Ⅲ)氧化成毒性小的五价砷(As(Ⅴ)),在生物修复砷污染方面具有应用价值。该研究从砷污染水稻土壤中分离到1株硝酸盐依赖型砷氧化菌,命名为HC11。根据表型特征、生理生化特性及16S rDNA序列同源性分析,将HC11归类为林杆菌属(Alsobacter sp.)。菌株HC11对As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的耐受能力分别为5 mmol/L和10 mmol/L。菌株HC11能够在厌氧条件下以硝酸盐为电子受体将1 mmol/L As(Ⅲ)氧化,氧化率为99%。用简并引物扩增As(Ⅲ)氧化酶大亚基aio A基因,获得了1100 bp的基因片段,其基因产物与已报道的Ancylobacter sp.OL1(ABJ55852)砷氧化酶大亚基aio A具有76%的同源性。