鼠伤寒沙门氏菌asd基因的克隆及序列分析

以鼠伤寒沙门氏菌标准株基因组DNA作为模板,用PCR的方法扩增鼠伤寒沙门氏菌的asd基因并克隆入质粒pUC19,并对其进行测序,序列与文献报道一致。同时将质粒pYA248上的链球菌asd基因进行了置换,观察了分别含有链球菌asd基因与鼠伤寒沙门氏菌asd基因的质粒在减毒鼠伤寒沙门氏菌X4072中的生长情况,结果表明含有鼠伤寒沙门氏菌的asd基因的高拷贝质粒pUC19的菌株生长情况更好。为完善染色体/质粒平衡致死系统,构建减毒鼠伤寒沙门氏活菌疫苗奠定了基础。

猪源益生菌EP株突变株EP△asd的构建和初步应用

为研制更加安全的大肠杆菌疫苗株,并将其开发为新型活疫苗载体,本研究采用电转化将氯霉素抗性基因片段转化至益生菌EP株。采用同源重组技术使氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧asd基因序列与益生菌EP基因组中的asd基因发生同源重组。通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆,对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒p CP20以去除抗性基因,从而构建成EP△asd突变株。该缺失突变株可以与表达链球菌asd基因的质粒形成功能性互补,转化有上述质粒的EP△asd突变株可长时间定居于仔猪肠道。本研究为进一步开发以益生菌EP△asd为染色体—质粒平衡致死系统宿主菌的用于预防仔猪肠道性传染病的细菌活载体疫苗研究奠定基础。

大肠杆菌asd基因PCR引物设计及其长模板PCR扩增

目的获得大肠杆菌全长ａｓｄ基因。方法采用计算机引物设计软件，长模板ＰＣＲ扩增法及限制性内切酶酶切分析。结果设计一对Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因ＰＣＲ引物；经长模板ＰＣＲ扩增获得１５１０ｂｐＰＣＲ扩增片段；经限制性内切酶酶切分析，证明该片段与电脑查询的Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因酶切谱相同。结论以本文设计的引物用长模板ＰＣＲ扩增法得到的片段初步确认为Ｅ．ｃｏｌｉａｓｄ基因。

痢疾福氏2a asd基因的克隆及其序列分析

本文根据大肠杆菌 (E .coli)K12asd基因两侧序列设计了一对引物 ,用全菌PCR扩增了福氏 2aT32株的asd基因及其两侧序列。对PCR产物的初步测序结果表明 ,在asd基因两端存在BamHI位点。为了防止由PCR扩增带来的差错 ,我们又从福氏 2aT32株染色体中克隆了全长的asd基因。序列分析的结果表明 ,福氏 2aT32株asd基因的序列与E .coliK12的完全一致 ,全长 16 80bp ,其两侧序列也与E .coli具有高度的同源性。这为以asd基因作为靶基因构建痢疾菌的载体宿主平衡致死系统创造了条件。

禽伤寒沙门氏菌SG9R株asd基因缺失株平衡致死系统平台的构建

为研发以禽伤寒沙门氏菌(SG)SG9R弱毒疫苗株为载体表达外源基因的活菌疫苗,本研究利用Red同源重组系统对SG9R株基因组中编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶的asd基因进行敲除,构建SG9R△asd缺失突变株。该突变株在缺乏外源DAP培养条件下溶菌死亡,而在添加DAP或导入表达链球菌asd+质粒p YA3342后才能够恢复增殖能力,以此建立了以asd营养基因为筛选标志的SG染色体-质粒平衡致死系统。并且进一步采用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,将其克隆于asd+质粒p YA3342中,电转化于SG9R△asd缺失突变株中,通过无DAP培养条件的筛选,获得了表达GFP外源基因的SG重组菌,经体外连续25次传代后,鉴定结果显示,GFP仍能够在重组SG中持续稳定的表达。本研究结果为以SG弱毒疫苗菌株作为活载体的基因工程疫苗的研制提供简便易行的操作平台。

嗜水气单胞菌asd-1基因功能研究

asd-1基因编码天冬氨酸半醛脱氢酶,该酶可影响革兰氏阴性菌的细胞壁正常合成。为了研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)asd-1基因的功能,采用Overlap PCR方法敲除该基因,结果显示asd-1基因的敲除明显降低了嗜水气单胞菌的生长速度,但是不会导致突变株对二氨基庚二酸(DAP)的强制需求,进一步对氨基酸序列分析表明asd-1蛋白质较迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌的asd A蛋白质多出3个氨基酸,其中Asn-257导致asd A蛋白质中的关键活性位点Arg-267在asd-1蛋白质中改变为Val-267,该研究表明嗜水气单胞菌的asd-1基因突变显著降低其生长速度。

2拷贝SLT-ⅡvB在猪霍乱沙门氏菌C500crp^-/asd^-缺失株中的表达及小鼠免疫试验

为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗,从pMDSLT-Ⅱ中扩增去信号肽后的SLT-ⅡvB基因,将2拷贝SLT-ⅡvB与pYA3493连接。阳性质粒pYA2B电转化C500crp-/asd-缺失株,进行SDS-PAGE电泳和Western blotting,重组菌C500crp-/asd-(pYA2B)口服免疫小鼠,腹腔攻10 LD50的猪霍乱沙门氏菌强毒C78-1和2 LD50的猪水肿大肠杆菌强毒ED3株,计算攻毒保护率。结果显示,2 SLT-ⅡvB在C500crp-/asd-缺失株中获得了表达。C500crp-/asd-(pYA2B)免疫组对ED3的攻击能提供60%保护,而对照组不能提供任何保护。2组对C78-1攻击均提供100%保护,为研制仔猪副伤寒—猪水肿病二联疫苗及进一步提高免疫效果提供依据。

SG97A平衡致死系统的构建及其初步应用

敲除鸡伤寒沙门菌(SG)减毒疫苗株97Aasd基因,构建宿主载体平衡致死系统并表达新城疫病毒(NDV)F蛋白,构建二价活菌苗。PCR扩增两段位于asd基因外侧的序列作为等位基因,以氯霉素抗性(CmR)基因替代asd基因,构建自杀质粒pGMB151Δasd::CmR,通过E.coliχ7213与SG97A固相杂交,将质粒转入SG97A,反向筛选获得SG97AΔasd::CmR,利用质粒pCP20去除CmR后,DAP的依赖菌株命名为SG97AΔasd。将含asd基因的质粒pYA3334转入SG97AΔasd中构建宿主载体平衡致死系统,并表达NDV-F蛋白。结果表明,通过等位基因重组方法,成功构建SG97AΔasd及宿主载体平衡致死系统,重组菌能够表达NDV-F蛋白,并能在鸡体内诱导产生特异性抗体。本研究成功构建SG97AΔasd宿主载体平衡致死系统,并表达NDV-F蛋白及其诱导宿主产生抗体,为应用该系统构建二价活菌苗的研究奠定了基础。

霍乱毒素B亚单位基因在鼠伤寒沙门氏菌中的表达

本工作成功地将霍乱毒素 B 亚单位(ctx B)基因插入到带有天门冬氨酸β-半醛脱氢酶基因(asd^+)的 pYA248质粒中,并将它转化至天门冬氨酸β-半醛脱氢酶突变(asd^-)鼠伤寒沙门氏菌中。实验结果表明,ctx B 亚单位基因能在鼠伤寒沙门氏菌中高效表达,并且表达的蛋白能分泌到细胞外。动物实验结果也表明:该疫苗菌株能在肠粘膜细胞定居;口服及全身免疫均能产生较高的抗体,并能增强动物细胞的免疫功能;对伤寒、霍乱有毒株的攻击有良好的保护效果。该系统的应用为疫苗基因工程提供了一个新的途径。

基于蛋白质互作网络挖掘自闭症谱系障碍的功能模块与核心基因

自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)是一种具有高遗传性、临床异质性和生物复杂性的神经行为障碍类疾病。为挖掘ASD发生发展过程中的功能模块与核心基因,本文从自闭症谱系障碍疾病数据库获取ASD相关基因;利用STRING数据库构建ASD相关基因的蛋白质互作网络;通过MCODE算法对蛋白质互作网络进行模块分析并筛选核心基因;最后对各功能模块进行KEGG通路分析,根据富集到的通路类别评估功能模块之间的相互作用。结果显示,3个疾病基因数据库筛选出182个共有基因,构建的蛋白质互作网络包含171个节点和1041条边,其中NRXN1、GRIN2B、GRIN2A、DLG4、NLGN3、MECP2、CNTNAP2、BDNF、NLGN4X、FMR1等23个基因具有较高的连通度(degree)。从蛋白质互作网络中分析得到5个功能模块,包括68个核心基因。KEGG富集分析发现功能模块参与多个生物学通路,包括细胞黏附分子、钙离子通路、神经活性的配体-受体相互作用、多巴胺能神经突触等。分析结果提示,挖掘的ASD功能模块和核心基因大多集中在神经元活动、信号分子和信号传导等,且各模块相互作用共同影响ASD的发生发展。

基于大肠杆菌受体菌DH5α △asd缺失株的构建及作为基因转化、表达操作系统的评估

基于大肠杆菌(E.coli)染色体上asd基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red同源重组系统一步法构建E.coliDH5α的asd基因缺失突变株DH5α△asd::cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20介导二次同源重组,以去除上述缺失突变株中氯霉素抗性筛选基因。结合PCR扩增和测序结果,证明DH5α△asd缺失突变株的正确构建。该缺失突变株失去了在普通LB培养基上生长的能力,只有添加DAP或导入表达asd基因的质粒(asd基因互补试验)才能在LB培养基上生长,与原型DH5α比较,其生长速度和生长对数期、接受不同拷贝数质粒的转化效率几乎相一致。基于该缺失突变株构建出以asd营养基因为标志的大肠杆菌染色体-质粒平衡致死系统。体外培养连续传代50代次,pnirBMisL-fedF-asd质粒不丢失,并功能性表达F18大肠杆菌黏附素FedF。

F18大肠杆菌黏附素在染色体-质粒平衡致死系统中的表达

将含有启动子及核糖体结合位点RBS的E.coliK12菌株源asd基因克隆入表达质粒载体pnirBMisL-fedF中,构建重组表达质粒pMisL-fedF-asd,使该质粒中氨苄抗性基因失活的同时能表达fedF和asd基因。该重组质粒pMisL-fedF-asd转化E.coliDH5α宿主菌asd基因缺失株即DH5α△asd菌株后,表达F18E.coli黏附素的DH5α△asd重组菌能在不含DAP的LB平板生长,构成非抗性平衡致死系统。厌氧条件下诱导培养后,经玻板凝集反应、间接免疫荧光试验及易感仔猪小肠上皮细胞黏附试验表明,F18E.coli黏附素在DH5α△asd菌体表面得到了功能性展呈。经20次传代培养没有发现质粒丢失,F18E.coli黏附素在该系统中持续稳定表达。该染色体-质粒平衡致死系统的成功构建为研究F18E.coli黏附素亚单位疫苗在动物体内的免疫效果提供了一个安全有效的操作平台。

家族性孤独症家系中先证者与无症状同胞的全外显子组测序结果的比较分析

目的 本研究旨在为家族性孤独症的风险基因提供更多依据,进而可以为家族性孤独症家系中再生风险的产前诊断提供参考。方法 对1个家族性孤独症家系中先证者、无症状同胞及其父母进行全外显子组测序,自行设置合理条件对突变的注释进行初步筛选,Sanger测序验证突变,进一步自行选用合理指标筛选孤独症相关基因,比较先证者与无症状同胞的结果。结果 先证者Ⅳ1的所有变异中,突变有害性为高级的,且突变质量值为高度和中度的,且在HGMD数据库中涉及孤独症的,共包括21个初筛基因突变。进一步根据孤独症数据库中基因收录证据分值,AutKB中大于4分或AutDB中至少3分,筛选出候选孤独症相关基因共包括11个。这11个候选相关基因中,AutKB孤独症数据库中基因收录证据分值大于16分的是高可信的孤独症相关基因,包括LAMC3、JMJD1C、CACNA1H这3个。这3个基因的具体错义突变位点均是本研究首次报道的。除LAMC3、JMJD1C遗传于有孤独症家族史的父方Ⅲ1,还有无家族史的母方Ⅲ2来源基因CACNA1H的累加作用。无症状同胞不是无突变,先证者Ⅳ1因为突变基因较无症状同胞Ⅳ2多2个(LAMC3、JMJD1C)而发病。该先证者的父亲Ⅲ1与母亲Ⅲ2如果再生育,则产前基因诊断应该至少检测这3个高可信的孤独症相关基因。结论 该研究自行建立了从全外显子组测序结果中筛选高可信的孤独症相关基因的合理、可行方法,具有实际推广应用价值。该家系先证者的高可信的孤独症相关基因是LAMC3、JMJD1C、CACNA1H。可以为再生风险的产前诊断提供参考。