ASGR1在肝细胞癌中的意义及机制研究

目的·探究去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的意义及潜在机制。方法·通过R语言分析癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中ASGR1在肝癌患者中的表达情况并绘制相关生存曲线。利用人类蛋白质图谱(The Human Protein Atlas,HPA)数据库获得人体正常肝组织和肝癌组织的免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)数据来分析ASGR1的蛋白表达情况。利用流体动力学尾静脉注射(hydrodynamic tail vein injection,HTVI)递送方法,在免疫完全的小鼠肝脏中敲除Asgr1探究其在体内的致瘤功能,并通过蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)验证基因敲除效率。利用R语言进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析及相关性分析,利用基因探针富集(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)软件进行GSEA hallmark相关通路分析,利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)在小鼠肝癌组织中验证糖酵解关键基因表达水平。结果·ASGR1在肝癌组织中显著低表达,在肝癌患者中ASGR1的低表达与患者较差的总体生存期(overall survival,OS)、无疾病间隔(disease free interval,DFI)、无进展间隔期(progression free interval,PFI)和疾病特异性生存期(disease specific survival,DSS)相关;肿瘤分级程度越高的肝癌患者ASGR1基因表达水平越低。人体正常肝组织ASGR1蛋白的表达显著高于肝癌组织。在免疫完全的肝细胞癌小鼠模型中,小鼠内源性Asgr1敲除可增加肝组织中肿瘤结节的大小和数量。TCGA数据库中ASGR1低表达组肝癌患者富集到多条癌症及代谢相关通路,ASGR1表达与部分糖酵解关键基因表达呈负相关,Asgr1敲除组的小鼠肝癌组织中糖酵解水平高于对照组,提示ASGR1低表达很可能促进肝癌的生长发展,加强代谢重编程促进肿瘤的合成代谢发展。结论·ASGR1在肝癌患者中表达显著降低,与患者的预后呈正相关;小鼠体内敲除Asgr1可促进肝细胞癌的发生发展;ASGR1可以作为肝癌预后不良的潜在生物标志物和潜在治疗新靶点。

去唾液酸糖蛋白受体介导甘草次酸壳聚糖微球的质量评价

目的:甘草次酸具有多种药理作用,如抗肿瘤、抗炎和抗病毒等。对甘草次酸进行修饰,制成靶向缓释制剂可以使药物准确到达作用部位,降低对其他组织的伤害。实验制备去唾液酸糖蛋白受体介导的甘草次酸壳聚糖微球,并对所制备的微球进行表征和质量评价。方法:采用乳化交联法制备,并对壳聚糖微球的粒径、Zeta电位、红外光谱图、包封率和载药量、体外释放度及稳定性等方面进行考察。结果:制备的微球粒径为1.106~1.718μm,Zeta电位为(15.13±1.76)mV,包封率为82.4%,载药量为1.02%,24 h体外释放度为77.09%,稳定性有待提高。结论:去唾液酸糖蛋白受体介导的甘草次酸壳聚糖微球,可为研制靶向肝药物提供一定的理论依据和实践基础。

甲氨喋呤-乳糖酰基壳聚糖的制备及其体外实验

制备了不同乳糖酰基取代度的N-乳糖酰基壳聚糖(LCH),并通过红外光谱(IR)及核磁共振氢谱(1H NMR)对其进行了结构表征.体外放射性配基竞争结合实验结果显示,当乳糖酰基取代度为15·5%～38·9%时,LCH对肝实质细胞膜表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)具有特异亲和性,即具有潜在的肝靶向性.将甲氨喋呤(MTX)与壳聚糖以酰胺键偶联,制备MTX-壳聚糖(MTX-CH),再与乳糖酸反应生成目标产物MTX-乳糖酰基壳聚糖(MTX-LCH),并通过紫外分光光度法(UV)检测MTX的取代度为5·6%,乳糖酰基取代度为33·8%.溶解性实验结果显示,MTX-LCH溶于pH=1～14的水溶液;体外释放实验结果表明,MTX-LCH性质稳定,能明显延缓MTX的释放.

肝靶向抗病毒药NGA－ACV的制备及其趋肝性

以无唾液酸糖蛋白受体（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＳＧＰＲ）的特异性配体半乳糖基拟糖白蛋白（ｎｅｏｇｌｙｃｏａｌｂｕｍｉｎ，ＮＧＡ）为载体，通过丁二酰基桥将抗病毒药无环鸟苷（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ，ＡＣＶ）与ＮＧＡ偶联，得到肝靶向抗病毒药ＮＧＡＡＣＶ。差热分析和高效液相色谱分析结果表明，ＮＧＡＡＣＶ是共价键偶联物，且在血液中稳定性很好。将偶联物用１３１Ｉ标记后进行家兔放射性显像比较研究。结果，高、低药密度ＮＧＡＡＣＶ的肝脏放射性分别是全身放射性的８１．６％和８６．６％，其趋肝性无明显差别。研究小鼠体内高药密度１３１ＩＮＧＡＡＣＶ的分布，在５ｍｉｎ时肝脏放射性达到峰值，为注入量的８１．７±１０．４％。受体竞争抑制实验表明ＮＧＡＡＣＶ的肝靶向机理为受体介导的主动靶向过程。初步体外抗乙肝病毒比较研究表明，ＮＧＡＡＣＶ较ＡＣＶ的抗病毒剂量有明显降低。

^99mTc-DTPA-半乳糖人血清白蛋白在不同小鼠肝损伤模型中肝功能显像的应用

目的明确肝显像剂99mTc-DTPA-半乳糖人血清白蛋白(99mTc-GSA)在3种不同类型肝细胞损伤小鼠模型中不同的摄取和生物分布情况。方法3种小鼠模型分别为肝硬化、淤胆性肝损伤和肝肿瘤模型。肝硬化模型用腹腔内注射CCl4完成(每48小时腹腔注射0.4 ml 10%CCl4,共48 d);淤胆性肝损伤模型以结扎胆总管72 h建立;肝肿瘤模型用H22肿瘤细胞株种植肝包膜下10 d建立。各模型组小鼠和正常对照组小鼠均以0.1 ml(0.37 MBq)99mTc-GSA(2μg)注射尾静脉,5 min后断头处死,取出各重要器官或组织(肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾脏、胃、血液、骨骼、肌肉、肠道)称量,测定其放射性计数。同时血清学及肝脏病理学检查验证肝脏损伤。结果3个模型组和对照组中99mTc-GSA在小鼠肝脏均有显著浓聚(均>40%ID.g-1),但与对照组(90.05±10.55)%ID.g-1相比,肝损伤模型组的浓聚度均显著下降(P<0.001)。病理检查结果和建立模型时预期的病变相符;血清肝功能显示肝硬化模型组的损伤[天冬氨酸转氨酶为(235.3±14.7)U/L]轻于淤胆性肝损伤模型以及肝肿瘤模型[天冬氨酸转氨酶分别为(841.3±68.7)和(1 060.3±208.3)U/L];但肝硬化模型的浓聚度(72.20±2.13)%ID.g-1较淤胆性肝损伤模型(56.72±5.92)%ID.g-1及肝肿瘤模型(42.80±6.05)%ID.g-1显著增高(P<0.001)。结论99mTc-GSA在肝脏有显著浓聚,其浓聚程度与肝功能受损情况呈负相关。99mTc-GSA可能成为临床上反映肝功能的显像剂,如与三维扫描技术相结合,有希望建立评估肝脏区段功能的三维成像系统。

半乳糖基新糖白蛋白的制备及其对肝特异性受体结合试验的研究

作者用半乳糖经乙酰化、溴代、缩合、置换及加成反应制得2-亚氨基-2-甲氧基乙基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷,最后与人血清白蛋白偶连后得不同糖密度的半乳糖基新糖白蛋白(NGA),并用^(90)mTc标记后进行了动物及临床试验。结果^(99m)Tc-NGA-21的肝最大摄取率为82.6％,肝显像清晰。

肝靶向配体半乳糖基白蛋白和多聚谷氨酸

化学合成两类去唾液酸糖蛋白受体（ＡＳＧＰＲ）的人工配体———半乳糖基白蛋白（ＧａｌｎＨＳＡ）和半乳糖基多聚Ｌ谷氨酸（ＧａｌｎＰＬＧＡ），并以１２５Ｉ标记的去唾液酸胎球蛋白（ＡＳＦ）为标准配体，测定了合成配体抑制１２５ＩＡＳＦ与大鼠肝细胞膜ＡＳＧＰＲ结合的ＩＣ５０值．结果表明，Ｇａｌ１２ＨＳＡ、Ｇａｌ１５ＨＳＡ、Ｇａｌ２６ＨＳＡ、Ｇａｌ３０ＨＳＡ和Ｇａｌ３４ＰＬＧＡ均能够有效地抑制１２５ＩＡＳＦ与ＡＳＧＰＲ的结合，且前者与ＡＳＧＰＲ的亲和力随半乳糖基化程度的增加而增加．这些合成配体来源丰富、制备简单，适合于作为药物或基因肝靶向运送的导向配体．

脂质体的乳糖化修饰及其肝脏靶向性研究

目的探讨乳糖化白蛋白－脂质体交联物（简称交联物）作为肝脏靶向性药物载体的可行性。方法应用生物化学技 术合成交联物并对大鼠进行体内实验，了解交联物在动物肝脏的聚集量以及预先注射乳糖化白蛋白对交联物肝脏聚集 性的抑制作用；比较交联物、普通脂质体分别包裹的 α－干扰素及游离 α－干扰素在 ２．２．１５细胞中的抗乙型肝炎病毒效 应。结果交联物在肝脏的聚集量是脾脏的２倍以上，是其他脏器的４－９倍；预先注射乳糖化白蛋白后交联物的肝脏聚 集性减弱，与脾脏聚集量无显著差异；交联物包裹干扰素后抗乙肝病毒效应较普通脂质体包裹的干扰素及游离干扰素 显著提高，相当于普通脂质体干扰素１／４剂量、游离干扰素１／８剂量的抗病毒效应。结论文联物通过去唾液酸糖蛋白受 体实现肝脏聚集性，可望成为理想的肝脏靶向性药物载体。

肝靶向抗病毒药Lac-PLL-ACV的制备及其趋肝性研究

目的 减少抗病毒药阿昔洛韦 (Acyclovir ,ACV)在治疗乙型肝炎中的肝外毒副作用 ,获得肝靶向ACV偶联物。方法 多聚赖氨酸 (Poly L lysine ,PLL)在氰硼酸钠的催化作用下与乳糖反应生成乳糖化多聚赖氨酸 ,乳糖化多聚赖氨酸与咪唑化阿昔洛韦在 3 7℃pH 9 5的条件下反应合成偶联物乳糖化多聚赖氨酸 阿昔洛韦 (Lactosaminatedpoly L lysine acyclovir ,Lac PLL ACV)。偶联物经尾静脉注射进入小鼠体内后 ,收集小鼠血浆及肝脏样品 ,用高效液相色谱法测定药物浓度 ,研究偶联物的体内分布和药代动力学。结果 HPLC检测证实Lac PLL ACV在血浆中十分稳定 ,不易解离出ACV。偶联物的肝最大摄取率约为 60 % ,是ACV组的 10倍以上 ,偶联物肝中的T1/ 2 ,AUC ,CL分别为ACV的 4 2倍 ,5 6 6倍和 1/ 5 7,具有明显的肝靶向性。结论 乳糖化多聚赖氨酸作为肝去唾液酸糖蛋白受体 (Asialoglycoproteinreceptor ,ASGPR)介导的一种药物载体 。

去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的优化表达及亲和常数的测定

目的:表达及纯化抗去唾液酸糖蛋白受体(ASG-PR)的单链抗体的可溶性,并测定其亲和常数。方法:用噬菌体C1克隆感染E.coliHB2151,挑取单个菌落接种于2×TY培养基中,于37℃震荡培养过夜。将培养物作1∶100稀释并转种后,用终浓度为0.25、0.5、1.0mmol/L的IPTG,分别在37℃、25℃和20℃下诱导表达过夜。取其培养上清,用饱和硫酸铵沉淀后,以120g/LSDS-PAGE分析。另外,将饱和硫酸铵沉淀物用30mLPBS重新溶解、透析除盐后,用Ni2+螯合柱进行纯化,再以120g/LSDS-PAGE鉴定纯化scFvC1的纯度。用非竞争酶免疫法测定scFv的亲和常数。结果:用0.5mmol/LIPTG在25℃诱导过夜,表达的scFvC1的量较多,其相对分子质量(Mr)约为28000,以可溶性的形式存在于培养基中。通过Ni2+亲和柱纯化后scFvC1的纯度在95%以上,产量约为0.8mg/L。scFv的亲和常数为(2.31±0.36)×10-7mol/L。结论:以筛选的C1噬菌体感染E.coliHB2151后可表达低亲和力的可溶性scFv,对肝癌的基因治疗具有潜在的应用价值。

肝癌细胞膜上转铁蛋白受体和去唾液酸糖蛋白受体数量的变化

目的:研究肝癌细胞膜摄取转铁蛋白受体的变化。方法：采用免疫组化及配体受体结合法分别测定正常肝脏、肝癌组织及癌旁肝组织转铁蛋白受体及去唾液酸糖蛋白受体的含量。结果：肝癌组织中转铁蛋白受体的含量高于癌旁及正常肝组织，而去唾液酸糖蛋白受体却明显低于癌旁及正常肝组织。结论：该变化有利于肝癌细胞对转铁蛋白的有效提取，也增加了肝癌细胞对高度唾液酸化的转铁蛋白的相对特异性摄取。

肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的流式细胞分析

建立肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体 (ASGPR)的流式细胞分析方法 (FCM ) ,对正常及损伤鼠肝细胞、肝癌细胞 (BEL 740 2 )表面的ASGPR作同步比较分析 .以异硫氰酸荧光素标记的新半乳糖白蛋白 (FITC NGA)为ASGPR的特异性配体 ,以培养的正常肝细胞 (L 0 2 )为靶细胞 ,建立肝细胞表面ASGPR的FCM .测定并计算正常及损伤鼠肝细胞 ,BEL 740 2细胞与同一浓度的FITC NGA同步反应后的平均荧光强度 (MIF)值 .FITC NGA与L 0 2细胞表面ASGPR趋近饱和结合的浓度为 0 4mg/L ,该浓度下正常及损伤鼠肝细胞 ,BEL 740 2细胞的MIF值分别为 2 2 8 7、 5 81、 1 13.该结合可以被至少 5 0倍于FITC NGA的NGA或10mmol/L的EDTA完全抑制 .FCM能够良好地揭示FITC NGA同ASGPR之间的受配体结合特性 .该方法证实BEL 740 2细胞表面几乎没有ASGPR ,损伤鼠肝细胞表面ASGPR的数量较正常鼠肝细胞显著减少 .

半乳糖配体介导多烯紫杉醇脂质体靶向性研究

目的:研究经半乳糖配体修饰后的多烯紫杉醇脂质体(docetaxel liposomes modified with galactose ligand,Gal-DOC-L)在小鼠体内的组织分布,探讨Gal-DOC-L对肝脏的靶向作用。方法:采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatogra-phy,HPLC)测定各组织中多烯紫杉醇的药物浓度,以多烯紫杉醇普通脂质体(docetaxel liposomes,DOC-L)为对比,分别采用相对摄取率re、峰浓度比Ce和靶向效率te作为评价参数,对Gal-DOC-L的肝靶向性进行评价。结果:DOC-L和Gal-DOC-L的re分别为2.80和4.34,Ce分别为1.67和2.38,te分别为28.44%和38.91%。结论:药物经脂质体包封后对肝脏具有一定的靶向效应,而半乳糖配体的引入可进一步提高脂质体对肝脏的靶向性。

ASGP-R介导的乳糖酸-壳聚糖-SPIO纳米颗粒的制备及体外MR成像

目的:探讨去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)介导的肝细胞靶向磁性纳米颗粒应用于磁共振分子成像的可行性。方法:乳糖酸与壳聚糖偶联修饰超顺磁性氧化铁纳米颗粒,采用透射电镜与动态光散射纳米粒度分析仪对LA-CS@SPION进行形貌表征;MTT法检测细胞毒性;利用体外及体内磁共振成像验证磁性纳米粒对肝细胞的靶向增强作用;普鲁士蓝染色观察肝细胞铁颗粒摄取情况。结果:LA-CS@SPION显示超顺磁性,T2弛豫率为456±5.8mM‐1S‐1。普鲁士蓝染色显示肝细胞浆内大量铁颗粒聚集,同时加入乳糖酸后肝细胞内未见铁颗粒。结论:ASGP-R介导的LA-CS@SPION对肝细胞具有特异靶向性,可作为肝脏MRI靶向对比剂。

肝靶向抗疟药NGA－PQ的合成及其抗疟作用

以肝细胞表面的无唾液酸糖蛋白受体的特异性配基──半乳糖基拟糖白蛋白（Ｎｅｏｇｌｙｃｏａｌｂｕｍｉｎ．ＮＧＡ）作为载体，通过丁二酰胺桥，成功地与抗疟药伯氨喹（ＰＱ）偶联，制备了肝靶向抗疟药ＮＧＡ－ＰＱ，药密度达到１６．８±０．８５，糖密度达到２１．７±１．７３．经药效学试验，ＮＧＡ－ＰＱ的抗疟作用明显优于同剂量的ＰＱ。

ASGPR与HBV preS1蛋白之间相互作用的验证

目的验证去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)与乙肝病毒前S1蛋白(HBV preS1蛋白)之间的相互作用,确认ASGPR作为乙肝病毒肝细胞膜受体在介导乙肝病毒感染的分子机制中的作用。方法分别用哺乳动物双杂交及体外免疫共沉淀技术验证ASGPR与HBV preS1蛋白之间的相互作用,操作方法参照试剂盒说明书进行。结果哺乳动物双杂交实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在细胞环境中具有相互作用;免疫共沉淀实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在非细胞环境中具有相互作用。结论 ASGPR可能是介导HBV入侵的肝细胞膜受体之一。

Gal-BSA-SPIO制备及兔VX2肝癌模型与人肝脏ASG受体的MRI研究

目的尝试合成肝脏靶向对比剂乳糖基白蛋白超顺磁氧化铁(Gal-BSA-SPIO),探讨Gal-BSA-SPIO对肝癌的检出及其诊断价值。材料和方法采用还原胺法合成Gal-BSA。Gal-BSA与SPIO混合后超声振荡。建立20只兔的VX2肝癌模型,随机分为SPIO组和Gal-BSA-SPIO组,行MR平扫及增强。测定肝脏及肿瘤的T2值。对13例人肝脏标本(肝癌6例、肝硬化4例、正常肝组织3例)Gal-BSA-SPIO孵育后,Perl's染色,观察去唾液酸糖蛋白(ASG)受体分布。统计学方法:对增强前后各组的T2值进行t检验。结果Gal-BSA-SPIO平均粒径34.4nm。20只兔VX2肿瘤直径3～12mm,T1WI肝实质呈中等信号,肿瘤呈低信号,T2WI肝实质低信号,病灶为略高信号;GRET2*WI肝实质中等信号,肿瘤略高信号。增强扫描,SPIO组T2WI肝实质信号轻中度下降,与肿瘤对比提高;Gal-BSA-SPIO组T2WI肝实质信号显著下降,肿瘤呈明亮的"灯泡征"。正常肝脏的SPIO组和Gal-BSA-SPIO组增强后T2值明显下降,与增强前有显著性差异。肿瘤的SPIO组和Gal-BSA-SPIO组增强后T2值无明显下降,与增强前无显著性差异。组织学检查SPIO组,Kupffer细胞内见蓝染的铁颗粒;Gal-BSA-SPIO组,肝细胞内见较多的蓝染的铁颗粒,两组的肿瘤内未见蓝染的铁颗粒。Gal-BSA-SPIO孵育后,正常肝组织可见大量蓝染色,肝硬化及癌旁肝硬化组织均可见蓝染色;肝细胞癌罕见蓝染色。结论Gal-BSA-SPIO可以与肝细胞膜的ASG受体可特异性结合,通过受体介导的特异性对肝脏产生负向增强作用,明显提高肿瘤对比噪声比。

肝去唾液酸糖蛋白受体显像:三维分段肝功能评估的前景

去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是哺乳动物肝细胞表面的特异性受体,肝硬化和肝癌时ASGPR水平下降。利用99mTcGSA进行该受体的显像,能够得到HH15、LHL15、[R]0、R0等指标用于肝功能的评估;将这种功能性显像与单光子发射型计算机断层显像(SPECT)技术相结合,可以模拟肝脏切除的范围,并预测术后剩余肝脏的功能。此技术在国际上是一个新的课题,在国内尚无开展,用它来数字化的评估手术风险对患者手术方式的选择及预后具有重要影响。笔者结合正在进行的这方面部分研究,向读者作一介绍,以期在临床上发挥更好的作用。

双糖密度半乳糖基胰岛素的合成及肝靶向性初步研究

为有效提高半乳糖基化合物的糖密度以增加其趋肝性 ,作者采用分枝化合物 3,5 -二羟基苯甲酸为偶联桥 ,将半乳糖与胰岛素偶联 ,得到糖密度较单链桥法高一倍的双糖密度半乳糖基胰岛素 ,而后用 1 31 分别标记双糖密度半乳糖基胰岛素、单链桥偶联半乳糖基胰岛素和普通胰岛素 ,通过家兔体内示踪实验对比研究它们的肝靶向性。结果显示 :双糖密度偶联物的趋肝性最大 ,单糖偶联物次之 ,普通胰岛素最差 ,其肝最大摄取率分别为5 9.5 %、43.8%和 2 1 .5 %。而 3种标记物的鸡全身显像皆未见肝脏特异性浓聚 ,从而证明以分枝化合物为偶联桥 ,可以有效地提高半乳糖基化合物的糖密度 ,大幅度提高其趋肝性。

半乳糖修饰的反义硫代寡核苷酸的肝细胞导向及抗乙型肝炎病毒活性研究

人工合成两种半乳糖多聚赖氨酸导向配体，与荧光素标记的互补于ＨＢＶｍＲＮＡ多聚腺苷酸信号部分的２１－聚反义硫代脱氧核苷酸（ＡＳＯＤＮ）电性结合，与２．２．１５细胞共同孵育，４０ｍｉｎ后配体组对ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的抑制率为４１％～４７％和２８％～３１％，单纯ＡＳＯＤＮ组为１１％和５％；３ｄ后配体组为８８％～８９％和７１％～７４％，单纯组为６４％和５３％。经流式细胞分析，配体组使２．２．１５细胞荧光染色率达７５．３％和８３．８％；单纯组为２４．３％。结果表明，两种人工配体均具有良好的导向ＡＳＯＤＮ入肝细胞的功能，且可以明显提高ＡＳＯＤＮ抗ＨＢＶ的活性。