大豆7S球蛋白-大枣多糖复合物的制备、表征及抗原性

为了降低大豆的抗原性,通过糖基化反应制备了大豆7S球蛋白-大枣多糖(7S-JP)复合物.采用非对称场流分离技术在线联用紫外可见光检测器、多角度光散射检测器和示差折光检测器(AF4-UVMALS-dRI)研究糖基化反应温度、时间和物料比对7S-JP复合物结构的影响,对7S-JP复合物的回转半径、摩尔质量和构象进行表征;采用间接竞争酶联免疫吸附法探究7S-JP复合物的抗原性.AF4-UV-MALS-dRI结果表明:在反应温度为70℃、反应时间为20 min时,7S与JP糖基化反应效果最佳;当7S与JP的质量比为1∶3时,形成的7S-JP复合物结构紧密,有利于破坏其空间抗原表位,抗原抑制率为(69.1±0.99)%.

基于非对称场流分离技术分离表征天麻多糖:空间位阻转变效应

采用非对称场流分离(AF4)在线联用多角度光散射(MALS)检测器和示差折光(dRI)检测器(AF4-MALS-dRI)对天麻多糖(GEPs)的相对分子质量(M)、回转半径(Rg)和构象进行了表征。GEPs粒径分布较宽,在AF4分离过程中存在空间位阻转变效应,导致粒径大小不同的GEPs分子被同时洗脱,无法准确表征其M、Rg分布和构象。本文研究了恒定交叉流流速、指数衰减交叉流流速、样品质量浓度和垫片高度对空间位阻转变效应的影响。结果表明,较高的样品质量浓度会导致空间位阻转变现象的发生;垫片高度会影响样品的分离度和保留时间,改变空间位阻转变点(di);对于多分散GEPs样品,指数衰减交叉流流速不仅能调整di,而且能改善样品的分离度,缩短分析时间。在样品质量浓度为0.50 mg/mL、进样体积为50μL、检测器流速为1.0 mL/min、垫片高度为350μm、初始交叉流流速由0.2 mL/min呈指数衰减至0.05 mL/min、半衰期为2 min的条件下,解决了AF4分离GEPs时存在的空间位阻转变效应问题。此外,在最佳洗脱条件下研究了不同产地及不同超声时间对GEPs的M、Rg和构象的影响。结果表明,随着超声时间的增加,云南和四川产地GEPs的Rg和M均减小,分布变窄;当超声时间为15 min时,云南产地GEPs为松散的高度支化构象,四川产地GEPs为球状构象;当超声时间增加到30 min或60 min时,两产地GEPs的构象主要为高度支化结构,表明GEPs发生了降解。实验结果证明,在最佳洗脱条件下,AF4-MALS-dRI对GEPs的表征具有良好的重复性,GEPs的Rg和M相对标准偏差分别为0.5%和1.7%。

有机流动相下高分子材料的非对称场流分离

非对称场流分离技术没有固定相、分离压力小,与传统的凝胶渗透色谱相比具有天然优势,可以作为高分子材料表征的有效手段。但由于膜的相容性问题,场流技术一般运用于水相体系,很少用于有机相体系中。本文探索了不同半透膜在有机场流分离中的应用情况,摸索了有机体系下非对称场流的条件,成功在有机溶剂中分离了聚甲基丙烯酸甲酯和聚丙烯腈两种高分子材料。

非对称流场流分离技术的现状及发展趋势

场流分离是生物分析领域一项成熟的技术,将流体与外场联合作用于待分离物质,利用分析物某些理化参数上的差异进行分离。非对称流场流是其重要的分支之一,所施加的外力场为垂直方向的液流,分离过程于开放型的通道中在某种组成的载液迁移推动下进行,主要根据分析物与垂直施加的第二维液流之间的相互作用完成分离。非对称流场流在蛋白质、蛋白质复合物、衍生纳米级/微米级粒子、亚细胞单元和聚合物等分离中的应用日益广泛,主要归功于其直接应用于生物样品时可进行无损分离,因此生物分析物如蛋白质可以在生物友好型的环境中完成分离而不改变其构型,也无需使用降解载液。分离设备便于保持无菌状态,分析物可在生物友好的环境中维持其自然状态。该文简要描述了场流分离原理并罗列出其在生物分析领域一些卓越的发展和应用。

非对称场流分离技术用于纳米颗粒的表征

采用非对称场流分离技术(Asymmetrical flow field-flow fractionation,AF4)对标准聚苯乙烯颗粒粒径进行表征。利用非对称场流分离仪以0.1%SDS(十二烷基磺酸钠)和0.02%NaN3的水溶液为流动相,测定标准的聚苯乙烯纳米颗粒在流体流场作用下通过分离腔室的保留时间,以确定纳米颗粒的平均粒径。优化了聚焦时间、横向流速、进样量、主体流速等实验条件,建立了利用AF4准确表征纳米颗粒的方法,并与扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)的表征结果进行比较。结果表明,AF4的表征结果比SEM更接近于聚苯乙烯颗粒的标准粒径,具有更高的稳定性和准确度。本方法可作为纳米粒径表征的一种准确方法。

基于非对称场流分离技术分离表征小米淀粉

基于非对称场流分离技术耦合多角度激光光散射检测器和示差折光检测器,建立了分离表征小米淀粉的方法。研究了进样量、交叉流流速、半衰期(t1/2)、载液离子强度和pH值对小米淀粉分离效果的影响;考察了该方法的重现性;探究了小米淀粉分子结构。结果表明,在进样体积为50μL、进样质量浓度为0.50 g/L、交叉流流速为1.2 mL/min、t1/2=3 min、载液为10 mmol/L pH 7.00 NaNO3(含3 mmol/L NaN3)的条件下,小米淀粉分离效果最佳。该方法具有良好的重现性,得到的小米淀粉的回转半径相对标准偏差为3.4%、摩尔质量相对标准偏差为7.0%。

载液组成对于卵白蛋白在非对称流场流分离通道中膜吸附和聚集行为的影响

非对称流场流分离技术对于蛋白质等生物大分子的分析具有温和、分离范围广的特点。然而,在场流分离通道中,受载液组成的影响而产生的蛋白质与通道膜的相互作用和蛋白质在通道内的聚集行为,会影响分析物的回收率和尺寸形态,这些现象一定程度上限制了场流分离仪器的进一步应用。该文研究了载液组成对于卵白蛋白在非对称流场流分离中膜吸附和聚集行为的影响。考察了不同pH(6.2、7.4、8.2)、阳离子种类(Na^+、K^+、Mg^(2+))及多种离子强度(0~0.1 mol/L)等条件对卵白蛋白洗脱过程的影响。结果表明a)载液的离子强度越大,卵白蛋白的吸附和聚集行为越严重;b)pH和蛋白质的等电点pI的相对大小决定了蛋白质的表面电荷,从而影响蛋白质的吸附聚集行为;c)二价阳离子Mg^(2+)更易引发通道中蛋白质的吸附和聚集。这些结果有助于今后使用非对称流场流分离技术分析蛋白质样品时,改善载液组成以获得更高的回收率,降低蛋白质聚集作用,对AF4更广泛地应用于蛋白质生化分析中有较好的参考价值。

非对称场流分离技术在蛋黄浆质低密度脂蛋白粒径表征中的应用

通过自组装的非对称场流分离系统(AF4)与紫外可见光检测器联用分离表征了笼养鸡蛋、柴鸡蛋、鹌鹑蛋和鸭蛋蛋黄浆质中的低密度脂蛋白(LDL)。在近似蛋黄浆质生理条件下,研究了进样量、交叉流流速、膜的类型对AF4蛋黄浆质中LDL分离表征的影响;考察了该方法的精密度。在优化的AF4分析条件下,检测出了笼养鸡蛋、柴鸡蛋、鹌鹑蛋和鸭蛋蛋黄浆质中LDL的水力学粒径分布。LDL的AF4洗脱峰高和峰面积的日内精密度分别为1.3%和1.9%(n=7),日间精密度分别为2.4%和2.3%(n=7)。研究结果表明,该方法可用于分离禽类蛋黄浆质中的LDL,同时能够得到LDL水力学粒径分布。

非对称流场流分离-超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱用于过敏原蛋白表位筛选

应用非对称流场流分离(AF4)技术结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)对过敏原蛋白表位进行筛选。将选择的过敏原蛋白(虾原肌球蛋白,TM)酶解后经UPLC-QTOF-MS分析,建立蛋白质肽谱。将TM酶解后的肽段与免疫球蛋白E混合孵育30 min,孵育过程中含有抗原表位的特异性肽段与免疫球蛋白E(IgE)结合,未结合的肽段仍留在溶液中。将孵育后的溶液进行AF4分离,已结合的肽段随IgE一起由出口流出,未结合的肽段透过分离通道膜,滤出至废液。收集出口流出的组分进行UPLC-QTOF-MS分析,与蛋白质肽谱匹配,找到特异性肽段,进而检测抗原表位。本研究扩展了非对称流场流分离技术的应用,对过敏原蛋白表位的检测进行了初步探索,为过敏原蛋白表位的研究提供了一种新的研究策略。

基于场流分离技术分离表征血清中的脂蛋白

采用非对称场流分离系统与多角度激光光散射检测器、荧光检测器联用技术分离表征冠心病患者血清中脂蛋白.研究了恒定交叉流流速和指数衰减交叉流流速对非对称场流分析血清的影响.利用非对称场流分离系统分离并收集了血清主要成分片段,通过动态激光光散射仪对收集的样品片段进行了表征.研究结果表明,血清中游离的蛋白质和脂蛋白能被非对称场流分离系统分开;指数衰减交叉流流速不仅缩短了分析时间,而且提高了脂蛋白亚类片段的分离度.结果证明,非对称场流分离与多角度激光光散射检测器、荧光检测器联用技术是一种潜在的血清中脂蛋白的分离表征方法.

基于非对称场流分离研究玉米淀粉糊化

研究了氢氧化钠溶解法和二甲基亚砜溶解法对玉米淀粉结构的影响.采用非对称场流分离系统与多角度激光光散射检测器、示差折光检测器联用技术分离表征了玉米淀粉.同时,通过扫描电子显微镜、X线衍射、傅里叶变换红外光谱和差示扫描量热法对不同溶解方法得到的玉米淀粉凝胶的形貌和结构进行了表征.研究结果表明,氢氧化钠溶解法可以分解直链淀粉-脂质复合物,使非对称场流分离联用技术测得的玉米淀粉的粒径和摩尔质量分布更精确.

基于非对称流场流分离技术的纳米银分离监测方法

以纳米银（AgNPs）作为典型的纳米颗粒物,利用非对称流场流分离技术构建纳米颗粒物的分离监测方法。制备了柠檬酸盐稳定的AgNPs分散液,采用透射电镜、紫外可见分光光度计、Zeta电位分析仪对AgNPs分散液进行了表征。结果表明,AgNPs半径多数小于10 nm,最大吸收波长为400 nm,Zeta电位为-42.56 m V。采用非对称流场流分离仪对AgNPs进行粒径分离,得到UV-Vis信号谱图,并收集得到半径小于10 nm、10~30 nm、30~50 nm、50~70 nm、70~100nm范围的AgNPs颗粒,结合电感耦合等离子体质谱仪测定每个粒径范围内AgNPs的质量浓度。结果表明,该方法重现性良好,AgNPs在半径小于10 nm的范围内达到了UV-Vis吸收峰值,响应信号最高为0.022 5~0.027 5 V,表明半径小于10 nm的AgNPs浓度较高。半径小于10 nm、10~30 nm、30~50 nm、50~70 nm、70~100 nm范围内AgNPs的质量浓度分别为（1 021.86±61.74）μg/L、（323.23±45.83）μg/L、（72.90±32.14）μg/L、（44.64±9.28）μg/L、（39.12±5.04）μg/L,回收率为43.96%±0.84%。

非对称场流分离系统的构建及其在淀粉颗粒粒径表征中的应用

淀粉颗粒粒径与分子尺寸分别在1~100μm和20~250 nm之间,是影响淀粉功能特性的重要因素之一。非对称场流分离(AF4)是一种基于样品与外力场相互作用机制的分离技术,已应用于表征淀粉分子尺寸分布。商品化的AF4系统的粒径检测范围为1 nm~10μm,对于淀粉颗粒粒径表征具有一定的局限性。该文研制了AF4分离系统;考察了其在微米尺度下对红薯、莲子和大米淀粉颗粒粒径表征的性能;采用微米尺寸的聚苯乙烯乳化球(PS)标准样品验证了构建的AF4系统的分离性能。实验结果显示,构建的AF4系统对PS混合样品(粒径2、6、12、20μm)实现了基线分离,同商品化AF4相比提高了检测上线,具有分离表征淀粉颗粒的潜力。此外,该文研究了载液组成对淀粉颗粒分离表征的影响;通过光学显微镜验证了构建的AF4系统在微米尺度上对淀粉颗粒粒径分布的表征能力。最后,采用商品化的AF4系统串联多角度激光光散射检测器和示差折光检测器对3种淀粉分子进行了分离表征,考察了淀粉的溶解温度对其表征结果的影响。在摩尔质量106~108 g/mol范围内,红薯和莲子淀粉的回转半径和水合半径的比值(Rg/Rh)在0.9~1.1之间,大米淀粉的Rg/Rh在1.2~1.4之间。实验结果证明构建的AF4系统是一种快速、准确的淀粉颗粒粒径表征方法,与商品化的AF4系统结合可为研究淀粉尺寸分布与其功能性质之间的关系提供技术支持。

基于非对称流场流分离系统优化脂蛋白的分离条件

目的:使用自组装非对称流场流分离(asymmetrical flow field-flow fractionation,AF4)仪器对脂蛋白的分离条件进行优化,分析仪器的分离性能并验证载液黏度对分离效果的影响。方法:使用2种标准蛋白(碳酸酐酶和甲状腺球蛋白)初步验证自组装非对称流场流分离仪器的性能,标定分离通道相关参数(压制后的分离通道实际高度),进而通过四水平五因素的正交设计试验进行脂蛋白的分离条件优化,通过直观分析和方差分析评价差异具有统计学意义的影响因素,并对这些影响因素进行深入验证分析。结果:通过调节流速条件及载液条件得到碳酸酐酶和甲状腺球蛋白混合样品的分离图,根据流体动力学原理及Stoke’s公式计算得到分离通道高度为164μm。使用正交设计试验得到优化后的分离条件可实现高密度脂蛋白与低密度脂蛋白大于1.50的分离度(分离度为1.61和1.58),所选取的5种主要影响因素及其水平分别为分离总流速(3.00,3.50,4.00,4.50 m L/min)、聚焦时间(3.00,3.50,4.00,4.50 min)、过渡时间(0.5,1.0,1.5,2.0 min)、载液p H(6.8,7.00,7.20,7.40)、载液黏度(使用不同浓度的羟丙基甲基纤维素调节载液黏度,其浓度分别为0.00%,0.03%,0.06%,1.00%),正交设计试验结果显示,5种主要因素中载液黏度对分离度影响最大,结果差异具有统计学意义。进一步分析载液黏度的影响,发现增大黏度可有效提高分离度,但会带来增大负峰的作用。结论:自组装非对称流场流分离仪器可根据颗粒的粒径差异对脂蛋白进行有效分离,在优化的条件下可实现高、低密度脂蛋白的基线分离,载液黏度对分离度的影响差异具有统计学意义。

非对称场流分离检测鲍内脏多糖

[目的]建立非对称场流分离检测鲍内脏多糖的方法。[方法]采用非对称场流分离系统与静态光散射、光电二极管阵列和示差折光检测器联用技术分离表征鲍内脏多糖。以0.05 mol/L Na NO3[含0.02%(W/V) Na N3]为流动相,研究横向流速和样品浓度对非对称场流分离多糖的影响,并利用动静态光散射测量鲍内脏多糖的分子特性(分子量、均方根旋转半径、分子构象、流体力学半径)。[结果]不同横向流速对多糖的分离表征有显著影响;一定范围内,不同多糖浓度对分离效果及分子特性结果无显著差异。鲍内脏多糖分子量为(25.40±1.78) k D,均方根旋转半径为(16.70±0.30) nm,流体力学半径为(143.23±15.49) nm,分子为无规则线团构象。[结论]非对称场流技术适用于鲍内脏多糖的分离检测。

非对称流场流分离技术在纳米材料及生物分子表征方面的应用

场流分离作为一类分离技术可分离、提纯和收集流体中的悬浮物微粒,它是将流体与外场联合作用于待分离物质,利用样品质量、体积和密度等性质的差异实现分离,然后利用分离物质的保留性质来确定样品颗粒粒径及分布、分子量等性质。其中非对称流场流分离能够提供连续的、高分辨率的分离,近年来越来越受到科研人员的欢迎。本文介绍了场流分离的分类及其原理,重点介绍了非对称流场流分离的原理及其应用,包括非对称流场流分离的影响因素及与其他分离技术的比较;最后总结了该技术的发展趋势。

自行加工的非对称流场流分离仪器对蛋白质分离的应用研究

目的设计并加工一套针对生物大分子分离的非对称流场流分离(asymmetric flow field-flow fractionation,As Fl FFF或AF4)仪器,对仪器性能进行初步研究,为下一步实际样品的分离提供依据和参考经验。方法为了解决样品聚焦(focus)问题,自行研究了一种新的聚焦方式。以标准牛血清白蛋白和乙醇脱氢酶作为混合样品,对仪器性能进行验证。并通过改变进样/聚焦时间、横向流动速度(cross-in flow)和横向流出速度(cross-out flow),考察各因素对分离效果(分离度R表示)的影响。结果混合蛋白的分离度分别随聚焦时间的减少和横向流动速度的增加而增加,而横向流出速度的影响并不显著。结论该非对称流场流分离仪器已基本实现对混合蛋白的分离,预计可用于更为复杂的样品分离。

基于非对称流场流分离技术的蛋白分离研究

通过对肌红蛋白和牛血清白蛋白混合蛋白样品分离,研究了非对称流场流分离技术(AF4)分离蛋白时需要优化的参数及各个参数对分离效果的影响。首先应用正交设计实验考察样品进样量、横向流速、进检测器流速、聚焦时间对分离效果的影响,得到最大影响因素为横向流速,最优分离条件为:样品进样量20μL、横向流速5mL/min、进检测器流速0.2mL/min、聚焦时间6min。经验证此最优分离条件下分离度达到2.5。随后在最优分离条件下分别考察膜材料、缓冲盐浓度、分离腔室厚度对非对称流场流分离效果的影响。结果表明,截留膜选用再生纤维素膜,流动相缓冲盐浓度为20mmol/L时,满足非对称流场流分离技术分离蛋白样品的分离要求,随着腔室厚度的提高,分离度进一步增大。

基于非对称场流分离技术的水环境腐殖酸聚集特性研究

腐殖酸的聚集特性是影响其去除率及与其它污染物相互作用的重要因素,本文采用非对称场流分离技术对腐殖酸组分进行分离,配合示差折光检测器及多角度激光光散射器,对腐殖酸分子量的分布规律进行研究,探讨了水环境的化学条件对腐殖酸荷电状态和聚集状态的影响规律.结果表明,腐殖酸具有自我凝聚的特性;在p H较低和溶液离子强度较高时,腐殖酸胶粒的Zeta电位绝对值减小而分子量增大,腐殖酸胶粒聚集程度增大;随腐殖酸浓度增大,腐殖酸胶粒的Zeta电位绝对值减小,腐殖酸分子发生聚集而使胶粒分子量增大.当离子强度达到0.08mol·L-1,或浓度达到15 mg·L-1时,腐殖酸分子不仅靠氢键聚集在一起,还可能发生分子间的缔合.