Atelocollagen胶原支架在三维培养大鼠心肌中的生物相容性

目的探讨atelocollagen胶原支架在三维培养心肌细胞中的生物相容性,寻找三维培养心肌组织的条件和理想的支架材料。方法原代培养的大鼠心肌细胞经纯化后,将细胞悬液接种到胶原纤维支架上,动态观察第8d、16d、20d在atelocollagen胶原纤维支架上生长的细胞的变化,并进行光镜、扫描电镜和透射电镜观察。结果接种后第1d形成细胞-胶原支架搏动复合体,细胞与支架一起有节律的跳动;心肌细胞填充于支架网孔周围,并与支架融合;在透射电镜下,3个时间段均发现细胞与支架紧密相贴,融合在一起;在扫描电镜下发现,细胞在胶原纤维支架上贴附并充分伸展,相互融合成片。结论atelocollagen胶原支架的生物相容性较好,可作为三维培养细胞和组织的天然材料,适于心肌组织的立体培养。

在Atelocollagen胶原支架上体外三维培养乳大鼠心肌

目的在Atelocollagen胶原支架上三维培养具有收缩功能的乳鼠心肌细胞块,为进一步开展心肌组织工程奠定基础。方法乳鼠心肌消化培养、纯化后,种植到Atelocollagen胶原支架上进行三维培养。应用倒置显微镜动态观察心肌细胞在Atelocollagen胶原支架上的生长情况。对三维培养不同时间的心肌细胞块进行石蜡包埋、切片,分别进行HE染色、肌球蛋白免疫组织化学染色、肌球蛋白免疫荧光染色、透射电镜观察,对三维培养的细胞进行全面鉴定。结果心肌细胞种植到Atelocollagen胶原支架上6h开始贴支架生长,培养2d心肌细胞相互融合,并与Atelocollagen胶原支架形成复合体,连同支架一起搏动。培养6d细胞与细胞间结合较前更紧密。培养10d细胞在Atelocollagen胶原支架孔中交织成网状,18～20d细胞充满大部分支架网孔,进一步形成紧密的心肌细胞块。在整个培养过程中,心肌细胞始终保持良好的自律性收缩。形态学鉴定证明,支架网孔中生长的主要是心肌细胞,极少数为纤维样细胞。结论利用Atelocollagen胶原支架能够培养出较为理想的、具有收缩功能的三维心肌细胞块。

不同交联方法构建的胶原基支架及其性能表征

分别采用1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联法、甲基丙烯酸酐(MA)修饰光聚合交联法和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂(LAP)光交联法制备了3种胶原基支架材料,并对其微观结构、理化性能和生物学性能进行了评价。结果表明:这3种交联法制备的胶原基支架材料的孔洞结构具有显著差异,其孔径范围均为50~250μm,符合组织修复材料对孔径的需求。此外,通过MA复合光交联所得的胶原基支架材料(Col-MA),其抗压强度可达2.17 MPa,满足组织工程理想支架材料对力学性能的基本要求。生物相容性实验结果表明,这3种支架材料均能够为细胞生长提供合适的空间以及供应足够的营养物质。

磷酸化聚酰胺-胺交联胶原蛋白支架体内成骨能力初探

目的:探究磷酸化聚酰胺-胺(P-PAMAM)树状大分子交联胶原蛋白支架在体内成骨效能。方法:通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)对P-PAMAM进行表征,扫描电镜对胶原蛋白支架、聚酰胺-胺(PAMAM)复合胶原蛋白支架及P-PAMAM复合胶原蛋白支架进行形态表征。将3种复合支架植入SD大鼠颅骨骨缺损后,使用Micro-CT三维重建分析骨愈合过程中骨质、骨量的变化,采用HE染色及Masson染色对大鼠颅骨标本进行组织学分析。结果:FTIR显示PAMAM被成功磷酸化;扫描电镜显示,复合支架均具有良好的孔隙;体内成骨实验显示,与胶原蛋白支架和PAMAM复合胶原蛋白支架相比,P-PAMAM复合胶原蛋白支架具有更好的成骨诱导作用。结论:P-PAMAM树状大分子复合胶原蛋白支架在体内具有促进成骨作用。

胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架制备及其成软骨诱导

背景:天然骨形态发生蛋白2在体内弥散和降解速度较快,降低了局部浓度和治疗效果,单纯将骨形态发生蛋白2与组织工程支架复合后不能在体内长期停留,无法达到良好的缓控释效果。目的:制备并检测胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架的生物性能及成软骨诱导效果。方法:提取SD大鼠鼠尾胶原,采用真空冷冻干燥及化学交联法制备胶原软骨支架。通过快速克隆C112-同源重组法构建表达胶原结合域-骨形态发生蛋白2质粒,通过基因工程构建并导入大肠杆菌,分离纯化胶原结合域-骨形态发生蛋白2。将天然骨形态发生蛋白2与胶原结合域-骨形态发生蛋白2分别与胶原软骨支架结合,检测支架中骨形态发生蛋白2释放水平,采用CCK-8法及F-Actin染色法检测胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架的生物相容性;将骨髓间充质干细胞分别种植在两种胶原软骨支架上进行成软骨诱导,检测其成软骨诱导活性。结果与结论:①胶原结合域-骨形态发生蛋白2与胶原软骨支架的结合率高于天然骨形态发生蛋白2(P<0.05);体外浸泡于PBS中7 d,胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架中骨形态发生蛋白2的释放量小于天然骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架(P<0.05);CCK-8实验及F-Actin染色结果显示,胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架无明显细胞毒性,具有良好的生物相容性;②成软骨诱导14 d后的ELISA检测显示,胶原结合域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架组聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白A1的表达均高于天然骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架组(P<0.05);扫描电镜下可见,两组支架孔隙内壁上均可见较多骨髓间充质干细胞贴附生长,细胞形态及大小一致,排列紧密,未出现细胞碎裂或形态异常;③结果表明,胶原结构域-骨形态发生蛋白2-胶原软骨支架具有良好的生物性能及成软骨诱导活性。

DNA改性胶原支架促进口腔黏膜缺损愈合的研究

目的构建DNA修饰的胶原(DNA-Col)支架,探究改性后胶原(Col)生物相容性与促口腔黏膜软组织缺损愈合的性能。方法通过将Col材料浸泡于含DNA和磷酸基团活化剂的缓冲液中进行化学交联,以此构建出DNA-Col。通过甲基绿染色对DNA-Col上交联的DNA进行表征,并进一步利用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱对DNA与Col的交联机制进行初步探索。之后,利用扫描电镜观察DNA-Col的表面形貌。在评价DNA-Col的生物相容性方面,采用了溶血实验、CCK-8细胞增殖实验和活/死细胞染色实验。随后在体外将DNA-Col与人口腔成纤维细胞共培养,通过qRT-PCR检测转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子-1(FGF-1)的mRNA表达水平,分析DNA-Col促进口腔黏膜缺损愈合的潜力。最后,在大鼠腭部黏膜缺损模型中检测DNA-Col的促愈合能力,并于术后10 d对各组黏膜愈合情况进行组织切片分析。结果DNA-Col保持了Col的特征性结构且生物相容性良好。人口腔成纤维细胞与DNA-Col共培养后,TGF-β、FGF-1等与细胞增殖迁移相关基因表达显著升高,提示DNA-Col具有促口腔黏膜愈合的潜力。大鼠腭部黏膜缺损模型显示DNA-Col组在术后10 d时创面愈合率可达(97.04±2.07)%,显著高于普通Col组[(79.38±5.76)%,P<0.01]。结论DNA-Col具有良好的生物相容性以及促口腔黏膜软组织缺损愈合的性能。

胶原/无机物复合支架在骨缺损修复中的研究进展

胶原蛋白作为天然骨生物矿化的有机模板,在骨形成的过程中起着重要的作用,在临床上已被广泛地应用于骨缺损修复。但纯胶原支架力学性能差、成骨效果欠佳,在骨再生的应用过程中存在一定的局限性。通过引入无机生物材料制备的胶原蛋白/无机物复合支架则有效地改善了胶原基质机械强度低、成骨活性差的缺陷,在骨再生领域中显示出了巨大的潜力。因此,本文就目前国内外关于胶原/无机物复合支架在骨缺损修复中的研究进展作一综述,以期为未来新型胶原支架的设计及临床应用提供更多思路。

用聚多巴胺修饰胶原海绵支架缓释生长因子促进骨再生的研究

骨质疏松性骨缺损常因为成骨能力不足而难以愈合,本研究旨在设计并研究一种促进骨质疏松性骨缺损修复的生物活性支架。方法 通过聚多巴胺修饰胶原海绵支架表面,随后负载BMP-2制作能够释放生长因子的功能性复合支架。通过体外和体内实验验证该复合支架的促成骨性能。结果 该复合支架可在14天内持续释放BMP-2,具有良好的缓释效果。体外实验证实,该复合支架具有良好的细胞相容性并且可以促进BMSC的细胞增殖和成骨分化。体内实验表明,该复合支架能够促进家兔骨质疏松性股骨缺损的骨再生修复。结论 负载BMP-2的聚多巴胺涂层胶原海绵支架可以促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化,提升骨质疏松性骨缺损局部的成骨能力,为骨质疏松性骨缺损的治疗提供了新的可选择的治疗策略。

生物支架材料胶原膜交联前后的特性分析

目的比较胶原膜交联前后的生物特性,为胶原膜的应用奠定基础。方法取市售新鲜牛尾,分离肌腱,制备胶原蛋白,以紫外分光光度计测定胶原蛋白含量;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)波长扫描,氨基酸含量检测分析胶原蛋白特性。将制备的胶原蛋白,真空冷冻干燥,制备胶原膜,采用戊二醛交联。大体观察及扫描电镜观察交联前后胶原膜形态,并测定胶原酶溶解时间、pH值、吸水性能及抗撕强度。取自愿捐赠的骨髓制备BMSCs,按2×103/100μL浓度接种于交联前后胶原膜上培养7d,测量细胞吸光度(A)值及扫描电镜观察。结果制备的胶原蛋白含量约为2mg/mL,最大吸收波长约为230nm。胶原蛋白氨基酸分析显示,甘氨酸含量约为21.47%,脯氨酸12.04%,羟脯氨酸10.18%,未检出色氨酸。交联前胶原膜为白色海绵状,孔径较大且不均匀,pH值为4.5～5.0;扫描电镜观察为孔网状结构,孔径大;吸水力为其重量的61倍,抗撕强度为210g/cm3,胶原酶溶解时间为30min。交联后胶原膜变薄,无色,半透明,致密,柔韧性好;镜下可见致密排列的胶原纤维成网状;pH值为6.5～7.0,吸水力降低,抗撕强度约为3400g/cm3,胶原酶溶解时间为90min。细胞增殖实验表明,细胞在交联前后的胶原膜上均能良好生长,A值差异无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜见BMSCs在交联后的胶原膜上生长良好。结论从牛肌腱中成功提取胶原蛋白,并制备胶原蛋白膜。经化学交联剂交联后,胶原膜仍具有良好的生物学特性,且理化性质优于交联前,可作为生物支架材料,用于皮肤创伤修复等研究领域。

壳聚糖与型胶原复合制作组织工程软骨支架及其性能研究

目的 探讨采用壳聚糖与 型胶原复合制作新型组织工程软骨三维多孔支架的方法,并对其理化性能进行检测。 方法 将精制88%脱乙酰度壳聚糖溶于0 .2 mol/ L 醋酸溶液制成2 %溶液,高纯度猪 型胶原溶于0 .5 m ol/ L醋酸溶液制成1%溶液,两者按4∶1(重量比)充分搅拌混合,采用冷冻干燥法制成壳聚糖与 型胶原复合支架。采用碳化二亚胺/ N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联,力学测定比较支架交联前后的强度变化,扫描电镜观察其超微结构,于2、4、6和8周经溶菌酶体外降解实验测定其体外降解性。 结果 制备的复合支架成形良好,交联后其力学强度明显增加。扫描电镜显示壳聚糖与 型胶原成分在支架内分布均匀,支架内孔洞相互连通似海绵状,孔径10 0～2 5 0 μm。各时间段复合支架体外降解较单纯壳聚糖支架快。 结论 壳聚糖与 型胶原复合成功地制作成了三维多孔复合支架。其理化性能及体外降解测定,可以作为支架载体,应用于组织工程软骨的构建。

角膜组织工程支架壳聚糖-胶原复合膜的性能

制备了壳聚糖-胶原角膜组织工程支架,考察了复合膜支架的光学性能、力学强度、结晶性、吸水率、亲水性、微观形貌及细胞亲和性,发现支架内胶原与壳聚糖两种分子间存在较强的相互作用,且具有良好的相容性,支架表面平滑均一,内部呈现层状有序结构.壳聚糖-胶原复合膜具有优异的透光率和适宜的湿态力学强度.细胞培养实验中,人角膜缘上皮细胞能在支架上较好地粘附和增殖分化,显示复合膜支架具有良好的细胞亲和性.结果表明壳聚糖-胶原复合膜有望成为一种性能良好的角膜组织工程支架.

多孔β-磷酸三钙/胶原支架与犬牙周膜细胞三维复合体的构建

目的:探索用多孔β-磷酸三钙/胶原(β-TCP/col)支架与犬牙周膜细胞(PDLCs)在体外构建三维复合体。方法:分离培养犬PDLCs,并对其来源进行鉴定;利用甲基噻唑基四唑法检测β-TCP/col浸提液对PDLCs增殖的影响;并将第3代PDLCs以2×105/mL的浓度接种于β-TCP/col支架上进行三维复合体的体外构建,用扫描电镜观察。结果:β-TCP/col浸提液对犬PDLCs增殖无不良影响;PDLCs可在材料的三维结构上贴附生长,细胞充分伸展,且表面可见明显分泌物。结论:多孔β-磷酸三钙/胶原支架与犬牙周膜细胞具有良好的生物相容性,二者可在体外构建成三维复合体,提示该材料具有成为牙周组织工程理想支架材料的潜力。

利用胶原构建皮肤组织工程支架的研究

目的 利用胶原构建皮肤组织工程支架。 方法 用 Na2 S、弹性蛋白酶预处理胎牛皮得到胶原纤维 ;经蛋白酶 M降解胶原纤维后 ,0 .5 mol/ L 醋酸溶液溶解得到酸溶性胶原 ;再用蛋白酶 N处理上述酸溶性胶原 ,最终得到生物相容性良好的胶原溶液 ;将胶原溶液构建皮肤组织工程支架。通过 SDS- PAGE试验 ,分析酸溶性胶原分子量及基本结构 ;用皮肤组织工程支架材料包覆大鼠创面 ,观察创面愈合情况 ,研究支架材料对大鼠创伤愈合的影响 ;在支架材料上种植成纤维细胞 ,观察细胞扩增情况 ,以及支架材料对细胞移植影响。 结果 通过特异性蛋白酶 M处理得到的酸溶性胶原 ,显示典型的 型胶原 SDS- PAGE图谱 ;构建的皮肤组织工程支架呈多孔海绵状 ,孔径为 5 0～ 2 0 0 μm;在支架材料上种植成纤维细胞扩增情况良好 ;用于修复大鼠创面 ,具有促进创面愈合作用。 结论 酸溶性胶原经蛋白酶 N处理后 ,生物相容性良好 ,适合于皮肤组织工程支架的构建 ,并具有良好生物活性。

黄芪植入可控降解胶原支架控释促血管生成的效应

目的:将中药黄芪载入胶原支架内,通过对胶原支架进行修饰,观察黄芪能否代替生长因子起到促进血管生成疗效,并了解黄芪与生长因子是否有协同作用。方法:实验于2004-07-01/2006-07-01在德国亚琛工业大学生化研究所及江苏省中医院中心实验室进行。首先通过不同的EDC/NHS与肝素钠比例来交链修饰Ⅰ型胶原(EDC与NHS质量比固定为1∶0.6,EDC与肝素钠比例为0.2￣4),然后将1mL黄芪注射液(相当于3mg生药黄芪)载入修饰后的胶原内。体外通过甲苯胺蓝法测定修饰后胶原内肝素含量,胶原酶降解法测量胶原体外降解率,同时对胶原的亲水性及自由氨基团进行测定。体内通过鸡胚绒毛尿囊膜模型进行血管计数及血红蛋白测定。结果:①体外实验结果:通过对胶原的修饰程度,可以控制胶原内的肝素含量、体外降解率、自由氨基团含量、亲水性大小。②体内实验结果:黄芪注射液1mL载入修饰后的胶原较载入未修饰的胶原,可以明显促进鸡胚绒毛尿囊膜内微血管生成,提高胶原内血红蛋白含量(P<0.01),其疗效与重组人体血管内皮生长因子载入修饰后的胶原内相当,且与血管内皮生长因子有协同作用的趋势。结论:通过对胶原的修饰来控制胶原的体外降解,载入黄芪后,使黄芪促血管生成疗效增强,达到与血管内皮生长因子载入后的疗效相当,其作用机制有待进一步研究。

骨髓间充质干细胞种植Ⅰ型胶原支架材料修复关节软骨缺损的初步研究(英文)

目的研究骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)种植在型胶原支架材料(typecollagen-glycosaminoglycan,CG)上,软骨定向诱导后修复关节软骨缺损的可能性。方法将来源于10只成年实验犬骨髓的贴壁细胞培养传代至第3代,收集后以2×106密度种植于直径9mm,厚3mm(干样品尺寸)干热交联处理(dehydrothermaltreatment,DHT)的CG材料中,软骨诱导培养基诱导培养21d。观察每日细胞-材料复合体直径与初始直径的百分比,反应其收缩性。型胶原及平滑肌肌动蛋白(smoothmuscleactin,SMA)免疫组织化学染色观测体外软骨形成情况。将体外诱导培养的细胞-材料复合体植入实验犬膝关节软骨缺损模型,12周后取材观察。结果诱导培养过程中细胞-材料复合体直径随时间延长而下降。21d后,细胞-材料复合体收缩至初始直径的64.4%±0.3%;组织学见:材料的孔隙收缩,新合成的基质使细胞-材料复合体的多数区域变为实体组织;型胶原及SMA染色阳性。植入实验犬膝关节软骨缺损12周后,犬膝关节功能恢复,关节软骨缺损处有软骨样组织填充。结论将MSCs种植于CG材料中,经软骨诱导培养后并植入软骨缺损后能形成含有II型胶原的软骨样实体组织。

3D打印丝素蛋白/胶原蛋白支架的制备及性能

背景:目前,大量研究者致力于寻求可制备出具有优良孔隙、力学性能佳、生物相容性好的三维多孔支架材料方法,其中3D打印技术的快速发展为此提供了较好的技术支持。目的:采用3D打印技术制备丝素蛋白/胶原蛋白复合支架,并对其进行表征。方法:采用3D打印技术制备丝素蛋白/胶原蛋白复合支架,设置丝素蛋白与胶原蛋白的质量比分别为4∶2、4∶4,检测两种复合支架的孔隙率、吸水膨胀率、力学性能及孔径。将第3代大鼠骨髓间充质干细胞接种于两种复合支架上,接种13 d时进行MTT检测,接种14 d时进行苏木精-伊红染色和扫描电镜观察。结果与结论:14∶2复合支架组的孔隙率、孔径、吸水膨胀率均大于4∶4复合支架组(P<0.05),两组复合支架的弹性模量比较差异无显著性意义;2随着接种时间的延长,两组复合支架上的骨髓间充质干细胞数量逐渐增加,4∶2复合支架组细胞数量始终多于4∶4复合支架组(P<0.05);34∶2复合支架内部细胞较多且分布均匀,4∶4复合支架内部细胞较少且分布不均匀;4结果表明,将丝素蛋白与胶原蛋白以质量比4∶2混合,采用3D打印技术制备的丝素蛋白/胶原蛋白复合支架具有良好的理化性能和细胞相容性。

胶原支架增强自固化磷酸钙骨水泥的力学及成骨性能研究

[目的]研究胶原支架(CS)对磷酸钙骨水泥(CPC)的力学及其在体内成骨的影响。[方法]试验分CPC/CS及CPC两组,三点弯曲试验测试材料的强度和弹性模量;组织学观察材料植入兔股骨22及54周的成骨状况。[结果]CPC/CS比CPC的弯曲强度、韧性强度分别提高了64.2%、3 933.3%,弹性模量降低了45.7%;组织学显示22周CPC/CS内的胶原支架已完全被新骨替代,CPC只在边缘有少量成骨及材料降解而内部无成骨;54周CPC/CS已大部分降解孔化,孔内充满大量新骨及髓样组织,而CPC边缘区的成骨及材料降解虽比22周时明显,但其内部仍未见成骨。[结论]胶原支架既可改善CPC的力学性能,又能促进新骨长入CPC/CS复合材料内部,因此,CPC/胶原支架是较好的骨缺损修复材料。

聚乙烯醇/胶原共聚物在组织工程前交叉韧带支架材料中的实验研究

目的 :探索体外构建组织工程前交叉韧带 (anteriorcruciateligament,ACL)的支架材料。方法 :聚乙烯醇 (polyvinylalcohol,PVA)与胶原共聚后 ,深低温冷冻干燥成形、制孔。用酶消化法体外培养ACL细胞 ,种植到该支架上 ,立体培养。结果 :支架的表面和孔内均有细胞生长 ,状态良好。结论 :聚乙烯醇 /胶原共聚物支架具有良好的组织相容性和力学相容性 ,适合体外培养ACL细胞 ,通过进一步改善力学性能 ,有可能成为体外构建组织工程前交叉韧带的理想支架。

海绵状胶原膜制备真皮支架及其生物活性研究

目的：制备海绵状胶原膜，探讨其作为真皮支架的可行性。方法：酸溶法提取猪皮胶原，冻于成膜。将胶原膜包埋于SD大鼠皮下，定期活检以检测其组织相容性、血管化能力及降解速度。结果：制备的胶原膜具有密集的相互贯通的微孔结构，且具有一定的强度与韧性，适于手术操作。SD大鼠皮下埋藏试验表明组织相容性较好，无急性炎症反应，血管化能力较强，降解速度慢，真皮构架稳定性好。结论：海绵状胶原膜可作为真皮支架移植于创面。

碳化二亚胺交联的胶原-硫酸软骨素支架材料构建人工真皮的研究

目的 探讨以胶原 -硫酸软骨素支架材料构建人工真皮的可行性。 方法 以碳化二亚胺 (EDC)为交联剂构建胶原 -硫酸软骨素 (CS)支架体系。通过光电子能谱、扫描电镜、HE染色观察及力学性能测试等对材料的理化性能进行表征。同时分离培养人胚真皮成纤维细胞 ,将体外扩增的成纤维细胞接种在支架上 ,制备人工真皮。通过组织学、免疫组织化学 ,与传统的胶原海绵人工真皮的性质进行比较。 结果 胶原 - CS支架是三维多孔海绵状结构且空隙均匀 ,与胶原支架比较 ,断裂强度提高 ,并且材料表面极性基团增加。成纤维细胞在胶原 - CS支架材料上生长良好 ,形成人工真皮。 结论 胶原 - CS人工真皮具有优越的生物学和力学性能 ,成纤维细胞在胶原 - CS支架上黏附、增殖情况优于胶原真皮。