ARTP-ALE Optimized Selection of Low Acetaldehyde Producing Brewer's Yeast and Fermentation Validation

Higher levels of acetaldehyde in beer are one of the major concerns in the current beer industry.Yeast produces acetaldehyde during alcoholic fermentation,and its modification significantly affects beer flavor and quality.A different mutant strain with lower acetaldehyde production and improved ethanol tolerance was constructed using the ARTP-ALE mutagenesis strategy with 4-methylpyrazole-disulfiram.As a result of the mutation,the alcohol dehydrogenase activity of the mutant strain decreased to about 71.22%of that of the wild-type strain.At the same time,the fermentation properties and genetic stability of the newly screened strain showed slight differences from the wild-type strain,and there were no safety concerns regarding industrial use of the mutant strain.

Mutation breeding of high 4-androstene-3,17-dione-producing Mycobacterium neoaurum ZADF-4 by atmospheric and room temperature plasma treatment

Steroid medication is used extensively in clinical applications and comprises a large and vital part of the pharmaceutical industry. However, the difficulty of separating 4-androstene-3,17-dione （AD） from 1,4-androstadiene- 3,17-dione （ADD） restricts the application of the microbial transformation of phytosterols in the industry. A novel at- mospheric and room temperature plasma （ARTP） treatment, which employs helium as the working gas, was used to generate Mycobacterium neoaurum mutants producing large amounts of AD. After treatment of cultures with ARTP, four mutants were selected using a novel screening method with a color assay. Among the mutants, M. neoaurum ZADF-4 was considered the best candidate for industrial application. When the fermentation medium contained 15 g/L phytosterols and was cultivated on a rotary shaker at 160 r/min at 30 ~C for 7 d, （6.28＋0.11） g/L of AD and （0.82＋0.05） g/L of ADD were produced by the ZADF-4 mutant, compared with （4.83＋0.13） g/L of AD and （2.34＋0.06） g/L of ADD by the original strain, Iv~. neoaururn ZAD. Compared with ZAD, the molar yield of AD increased from 48.3% to 60.3% in the ZADF-4 mutant. This result indicates that ZADF-4 may have potential for industrial production of AD.

ARTP诱变选育高产腺苷菌株及发酵条件优化

为获得高产腺苷菌株,实现降本增效,该研究基于一株腺苷产生菌枯草芽孢杆菌SB-37,对其进行ARTP诱变选育,采用单因素实验和响应面方法优化菌株发酵条件。结果表明,最佳处理时间为30 s,菌株诱变致死率为98.75%。比对初始菌株腺苷产量,获得8株高产腺苷突变株,其中菌株Q40-2-37腺苷产量最高,为6.20 g/L,是出发菌株的2.58倍。该菌株最适发酵条件为葡萄糖99 g/L、蛋白胨25 g/L、pH 7.04、接种量8.03%、发酵时间72 h,此条件下,腺苷产量为6.92 g/L。该研究结果为高产腺苷菌株的诱变选育和发酵条件的优化提供了技术支撑。

常压室温等离子体(ARTP)诱变对凡纳对虾不同家系幼体发育及仔虾抗逆性状的影响

为研究物理诱变对虾类前期幼体发育及抗逆性状的影响,探讨通过诱变技术增加选育群体遗传多样性和可利用遗传变异的可行性,本研究利用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对4尾来自不同家系(A、B、C和D)的凡纳对虾(Penaeus vannamei)个体所产的受精卵(原肠胚期)分别进行相同功率(360 W)、不同时间(2、4、8和12 min)的批量诱变处理,并对孵化率、肢芽期孵化畸形率、存活率、变态率以及仔虾低氧耐受性和氨氮胁迫指标进行分析。结果显示,ARTP对凡纳对虾进行诱变处理后在不同家系间有一些共性的规律,在幼体发育前期阶段,4个家系随着诱变时间的增加,肢芽期畸形率均呈上升趋势,孵化率均呈下降趋势;与未经过诱变的对照组相比,除A和D家系诱变2 min组外,其余处理组肢芽期孵化畸形率均显著升高(P<0.05);除A家系诱变2 min组外,其余各家系处理组孵化率均显著降低(P<0.05);肢芽期孵化畸形率和孵化率与诱变时间均呈现中度或高度相关;与对照组相比,A、B、C和D4个家系在相同阶段的同一处理组存活率的表现具有不定向性,A家系诱变8min组存活率显著降低(P<0.05),而C家系诱变4和8min组存活率显著升高,D家系诱变2和4 min组存活率显著降低,而诱变8 min组则显著升高。可能是诱变的不定向性以及诱变作用于个体造成的。通过存活率和各期变态率综合分析可得,低剂量(2min组)诱变死亡高峰期多发生于幼体发育后期,高剂量(4、8和12min组)诱变幼体死亡高峰期多发生于幼体发育中前期。对A家系幼体的低氧耐受性和氨氮胁迫测试结果表明,低剂量的辐射可能会在一定程度上提高低氧耐受能力;诱变2 min组和8 min组分别在氨氮胁迫实验第4天、第7天存活率很高,诱变对该家系幼体对抗氨氮胁迫的能力有一定的影响。说明ARTP诱变凡纳对虾受精卵在不同家系中幼体发育前期具有一些共性趋势,在幼体发育后期和性状的改变上具有不定向性。研究结果对凡纳对虾新种质创制及功能研究材料的制备提出了新的方法,并为凡纳对虾诱变育种提供了基础数据和科学依据。

红色诺卡氏菌高产菌的ARTP诱变选育与发酵条件优化

以红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)FIM-PO8为出发菌株,采用常压室温等离子体(ARTP)技术进行诱变,经筛选获得遗传较稳定的Nocardia rubra高产菌株FIM-PO8-16,并通过单因素实验和正交实验优化了菌株FIM-PO8-16的发酵工艺。确定最佳发酵培养基组分为:酵母粉2.5%、葡萄糖2.5%、蛋白胨0.5%、糊精1.0%;最佳发酵条件为:种子液菌龄30 h、初始pH值7.2、接种量2.0%、装料量100 mL/500 mL、转速230 r·min^(-1)、发酵温度32℃。在此条件下,FIM-PO8-16菌体细胞浓度大幅提高,达到8.31%。

适合青梅醋酿造的醋酸菌选育

以腐烂的青梅为筛菌对象,采用平板分离、产酸定性和青梅果醋发酵实验筛选出一株产酸能力强的热带醋酸杆菌(Acetobacter tropicalis)J-27。进一步采用常压室温等离子体(atmosphericand room temperature plasma,ARTP)诱变技术和高通量筛选(high-throughput screening,HTS)相结合的方法,获得了1株具有高耐酸性且酿造后具有典型青梅醋风味的醋酸菌J-2736。用该菌株进行青梅醋发酵实验,发酵结束时总酸质量浓度为62.47 g/L,且菌株对乙醇、乙酸耐受性良好,可以耐受体积分数10%的乙醇和40 g/L的乙酸。对青梅醋中的风味物质进行分析,其中醇类物质、酯类物质和羧酸类物质质量分数较高,分别占挥发性风味物质的11.7%、36.0%和45.9%。因此选育的热带醋酸杆菌J-2736能够较好适应青梅的高酸特性,具有工业应用的可行性。

常压室温等离子体诱变选育耐盐产香酵母菌株

利用常压室温等离子体(ARTP)技术对鲁氏酵母进行诱变,确定40 s为诱变的最佳时间,此条件下菌株的致死率为98.9%。以耐盐性为指标对诱变后的菌株进行初步筛选,获得一株耐盐性较强的正突变菌株S3-26。将出发菌株及筛选菌株S3-26分别添加到18%盐度的酱醪汁培养基中培养,发酵后进行挥发性风味成分对比分析。研究结果表明,出发菌株S组检出59种风味物质,突变菌株S3-26组检出63种,提高了6.78%。添加S3-26发酵的酱醪汁中醇类、醛类、酸类、酚类、酮类、呋喃类、吡嗪类和总风味物质含量均高于S组,其中醇类含量提高了28.50%,酚类含量提高了80.33%。OAV分析结果表明,S3-26组的典型风味物质含量高于S组,其中苯乙醛提高了45.91%,愈创木酚提高了47.59%,赋予了酱油花香和烟熏香,明显增强了酱油的香气品质。此外,经10次连续传代测试,突变菌株S3-26具有良好的稳定性,综合结果表明选育菌株S3-26具有应用于酱油发酵的潜力。

ARTP和NTG诱变选育的解脂耶氏酵母对酸肉风味的影响

采用常压室温等离子体(ARTP)和亚硝基胍(NTG)诱变技术处理解脂耶氏酵母C11,研究诱变前、后菌株的酶学性质。最终筛选出4株突变菌A6、A13、A14、N12,酶活分别为1.007,1.554,1.139,1.021 U/mL,是起始菌株的1.41,2.17,1.59,1.43倍。4株突变株的最适温度为50℃、最适pH值为8.0。乙醇对脂肪酶酶活有抑制作用,最适底物由C8酯变化为C4酯。将A13、N12接种到酸肉发酵中,采用固相微萃取结合气相色谱-质谱法测定样品中挥发性物质,结果表明接种突变株能很好地改善酸肉的感官品质,促进酯类、醛类、醇类等挥发性风味物质的产生,显著提高丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、庚醛、壬醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛和1-辛烯-3-醇的气味活性值(OAV),赋予酸肉玫瑰香味、蘑菇味、焦香味、水果味等风味。

异养小球藻ARTP诱变育种试验研究

对异养小球藻进行常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变确定最佳诱变条件,在最佳诱变条件下筛选突变株,并开展突变株的摇瓶培养再验证试验、遗传稳定性试验、50 L发酵罐试验。结果表明,异养小球藻的最佳致死时间为50 s;得到6株突变株,且其细胞数多于出发菌株、质量浓度明显高于出发菌株;突变性能可以稳定遗传,突变株可提前24 h到达发酵终点,发酵液中油脂产量高于出发菌株。

ARTP诱变灰葡萄孢霉筛选高产脱落酸菌株

目的:利用常压室温等离子体(Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP)技术对生产脱落菌的潜力宿主灰葡萄孢霉进行诱变,以获得遗传稳定性好的高产脱落酸的突变菌种。方法:利用酶解法去除灰葡萄孢霉细胞壁,从而获得灰葡萄孢霉原生质体。接着将灰葡萄孢霉原生质体在输出功率120 W,工作气流10 L/min,照射距离2 mm,照射时间120 s的条件下进行ARTP诱变处理。检测突变菌株的脱落酸产量,并对最佳突变菌株进行发酵优化。结果:与野生型相比,突变菌株的脱落酸生产能力有了不同程度的提高,其中突变菌株A4和A7的脱落酸生产能力显著提高,分别提高了26.3%和30.5%。进一步通过单因素实验,确定突变菌株A7的最佳发酵碳源和氮源成分为葡萄糖和黄豆粉,最佳接种量为8%。结论:采用ARTP诱变技术能够有效获得高产脱落酸的突变菌株,为脱落酸的工业化生产提供了有利支撑。

Improving vanadium extraction from stone coal via combination of blank roasting and bioleaching by ARTP-mutated Bacillus mucilaginosus

In order to improve leaching efficiency of vanadium from stone coal,the combination of blank roasting and bioleaching using Bacillus mucilaginosus(B.mucilaginosus)mutants was evaluated.The atmospheric and room temperature plasma(ARTP)technique was used to generate B.mucilaginosus mutants.The results showed that a mutant B.mucilaginosus BM-50,after ARTP irradiation for 50 s,had the highest acid production.The total content of the organic acid produced by B.mucilaginosus BM-50 was nearly doubled compared with the wild strain after 2 days.After 20 days,vanadium leaching rate with B.mucilaginosus BM-50 reached 18.2%,which was improved compared with the original bacteria(15.3%).A pretreatment via blank roasting for stone coal further improved the vanadium dissolution by bioleaching,namely,68.3%vanadium was extracted,which was much higher than that without blank roasting.It is shown that bioleaching by bacterial mutants by ARTP irradiation combined with blank roasting has great potential for improving vanadium recovery from low-grade vanadium bearing stone coal.

常压室温等离子体技术在微生物诱变育种中的研究进展

主要阐述常压室温等离子体诱变(ARTP)技术的概念、诱变机理和影响诱变效果的因素,以微生物和食用菌诱变育种为主要内容,重点介绍ARTP诱变技术在细菌、放线菌和酵母等微生物菌种改良和提升生物合成能力方面的应用,以及在食用菌新品种选育等研究中的应用,分析ARTP诱变技术在微生物和食用菌育种研究中具有的优势以及面临的挑战,并说明今后研究重点是通过提高快速筛选目标菌株的技术水平,结合高通量测序、转录组和蛋白质组等多组学技术,深入探究经ARTP诱变后微生物和食用菌的遗传规律和调控生物活性物质合成的机制,以期通过新技术的建立和应用,为食用菌和微生物育种研究提供新思路,进而推动微生物和食用菌的种质创新及产业可持续发展。

利用常压室温等离子体诱变选育工厂化金针菇新菌株

为确定金针菇常压室温等离子体处理的诱变致死率,创制工厂化金针菇新种质,本研究以上研1号菌株作为亲本,收集其孢子进行常压室温等离子体诱变后,采用多孢自交技术获得新菌株,再经工厂化小试初筛和中试复筛,最终获得新种质。结果表明,从108个突变自交菌株中获得出芽快且整齐、产量高、商品性状优良(菌盖厚实、菌柄较粗)的金针菇新品种上研A130,该品种为白色,菌盖呈球形、内扣,菌柄基部绒毛少,子实体干品中必需氨基酸总含量为2.57×10^(4)mg·kg^(-1)。工厂化栽培条件下,菌丝培养温度为20℃,子实体生长发育温度为4~18℃,瓶栽菌丝培养周期为22 d,子实体生育时间为26 d,平均单瓶产量为每瓶456.41 g。本研究结合新型诱变技术和传统选育方法,提高了亲本的突变率,为筛选具有目标性状的工厂化金针菇新菌株提供了数据支撑,对金针菇产业持续发展具有实践价值。

湖泊红球藻等离子诱变及其高产虾青素藻株培养条件的优化

为进一步提高湖泊红球藻(Haematococcus lacustris)的工业利用价值,本研究使用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变仪对湖泊红球藻进行等离子诱变。以藻细胞致死率为指标确定等离子诱变的适宜输入功率和诱变时间。诱变之后通过固体平板培养初筛和液体培养复筛获得高产虾青素的突变藻株。再以藻细胞密度为指标采用单因素实验及正交试验对高产藻株的营养生长阶段的培养条件进行优化,并筛选虾青素诱导阶段适宜虾青素积累的高光照条件。在优化的培养条件下多次继代后观察高产突变藻株的遗传稳定性。结果表明,湖泊红球藻等离子诱变的适宜条件是功率240 W、诱变时间150 s或功率400 W、诱变时间120 s。通过初筛和复筛获得生长快、虾青素产量高的突变藻株有11株,其中编号为HP3的突变藻株生长最快、虾青素产量最高,培养后藻细胞密度和虾青素产量较出发株分别提高了25.5%和61.6%。经过两阶段培养条件的优化,HP3的藻细胞密度和虾青素产量较优化前分别提高了14.3%和19.3%,达7.2×10^(5)cell/mL和31.264 mg/L。湖泊红球藻高产突变藻株HP3多次继代后藻细胞生长良好,遗传稳定,培养后藻细胞密度和虾青素产量均与初代培养相近。研究结果对湖泊红球藻产虾青素工业藻株的选育具有实际意义。

UV-ARTP复合诱变选育高产纤维素酶菌株

该研究以拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)TP-89为出发菌株,利用紫外(UV)和常压室温等离子体(ARTP)复合诱变方法对其进行诱变,并对其遗传稳定进行测定,以期筛选高产纤维素酶且稳定遗传的突变菌株。结果表明,出发菌株TP-89通过UV诱变100 s,ARTP诱变120 s后,筛选出一株纤维素酶产量高且稳定遗传的正突变菌株UA-67,其在产酶培养基上培养4 d时,滤纸酶活为2.59 U/mL、内切酶活为4.26 U/mL、外切酶活为7.79 U/mL,较出发菌株TP-89分别提高85.0%、125.4%和70.1%。

常压室温等离子体诱变与微生物微液滴培养选育谷胱甘肽高产菌株

为提升野生毕赤酵母菌株BY-1产谷胱甘肽的能力,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术得到诱变菌株BY-1-26。进一步在摇瓶培养过程中添加1,2,4-三氮唑,提高诱变菌株产量。最后将1,2,4-三氮唑作为筛选因子,利用微生物微液滴培养(microbial microdroplet culture system,MMC)仪对诱变菌株进行适应性进化,获得了1株高产谷胱甘肽的突变株BY-2-24,并对其遗传稳定性进行研究。结果表明:出发菌株BY-1经过ARTP诱变处理、抗性梯度平板初筛、MMC适应性进化、摇瓶复筛等,可以选育高产谷胱甘肽突变株。突变株BY-2-24摇瓶产量达(312.13±2.62)mg/L,较出发菌株提高134.26%,且经过7次传代培养,仍然具有较好的遗传稳定性。同时,生物量提高118.33%,表明诱变菌株的生长能力得到提高。研究表明,ARTP与MMC联合应用作为一种简便高效的微生物诱变方式,可用于定向诱变筛选高性能微生物菌株,为高通量选育目标菌株提供了参考。

采用常压室温等离子体诱变技术选育高产多糖黑木耳菌株

为选育高产多糖的黑木耳(Auricularia auricula)菌株,以黑威单片作为出发菌株,采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变原生质体,经过3轮迭代诱变,从菌丝生长速度较快的诱变菌株中筛选多糖产量较高的菌株,通过5代继代培养测定菌株的菌丝生长速度稳定性,采用拮抗实验观察菌株间的拮抗情况,通过简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat,ISSR)分子标记分析菌株间的遗传差异。结果表明:与黑威单片相比,诱变菌株D3-56的菌丝生物量和多糖含量分别提高15.02%和48.40%,诱变菌株D3-60的菌丝生物量和多糖含量分别提高13.15%和60.83%,诱变菌株D3-56和D3-60的多糖产量分别提高70.69%和81.97%;诱变菌株D3-56和D3-60菌丝生长速度稳定,且与黑威单片存在遗传差异。

高产β-葡聚糖酶里氏木霉的诱变选育、酶学性质及体外模拟消化研究

β-葡聚糖酶可水解大麦等谷物中的葡聚糖,降低葡聚糖在单胃动物消化道内产生的抗营养作用。为获得高产β-葡聚糖酶菌株,采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变里氏木霉(Trichoderma reesei),经初筛、复筛、遗传稳定性及酶学特性表征,突变株ARTP-9较出发菌株β-葡聚糖酶活力提高54.38%,为43.75 U/mL,产酶能力稳定遗传,酶的最适反应温度及pH分别为50℃和6.0,耐受温度为40~80℃,pH 2.5~6.5时酶活力稳定,Fe^(2+)、Mg^(2+)对酶活力有促进作用,Fe^(3+)、Mn^(2+)、Zn^(2+)、Ca^(2+)、Cu^(2+)对酶活力有抑制作用。以β-葡聚糖为底物,该粗酶的K m值和V max值分别为1.59 mg/mL和6.99μmol/(mg·min)。体外模拟消化实验表明,ARTP-9固态发酵酶制剂在胃期4 h黏度最低,为2.23 mPa·s;肠期21 h还原糖为0.70 mg/mL,是空白的3.2倍,差异显著(P<0.05),其大麦粉体外消化率为48.17%,较空白提升9.02%,差异极显著(P<0.01)。研究结果表明ARTP诱变技术能够显著提高里氏木霉β-葡聚糖酶活力,为其工业化生产奠定基础。

西索米星生产菌株的诱变选育及工艺优化

利用原生质体常压室温等离子体(ARTP)诱变方法选育西索米星高产菌株,经诱变筛选获得一株高产菌株I4-10,其西索米星的生物效价达到1389 U/mL,较原始菌株提高了35.4%。通过对高产菌株I4-10进行碳源、氮源优化,确定可溶性淀粉和牛肉粉是突变菌株I4-10的最适碳源和氮源。进一步采用响应面实验设计方法优化发酵培养基,结果表明黄豆饼粉和DL-蛋氨酸的添加量为显著影响因素,经优化其最适添加质量浓度分别为32.78 g/L和1.75 g/L。在此最适工艺下,西索米星的生物效价提高至1849 U/mL,较原始菌株提高了80%。最后对原始菌及高产突变株中西索米星代谢途径及菌株生长相关的关键酶进行转录水平比较分析,初步解析了突变菌株I4-10高产西索米星的机制。

益生菌遗传育种方法研究进展

益生菌的多样化益生作用使其在人类健康领域发挥着重要作用,基于益生菌生产的药品、食品和膳食补充剂也受到越来越多的关注。目前,研究人员致力于为药品和食品行业选育新型益生菌,以期为食品药品行业的发展提供新的思路。遗传育种为选育具有有益特性的益生菌菌株提供了一个很好的平台,这对提升益生菌的市场价值和人类健康具有重要意义。为了今后更好的开展益生菌育种工作,该文综述了原生质体融合、基因组重排、常压室温等离子体诱变及基因编辑技术[成簇规律间隔的短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated,CRISPR-Cas)技术和碱基编辑技术]等遗传育种技术的研究现状及在益生菌中的应用,并讨论了遗传育种的安全性,旨在为优良益生菌的选育提供参考,促进益生菌资源的开发和利用。