系统性红斑狼疮特异性抗原60KD Ro/SSA的提取和纯化

目的建立从猪脾纯化Ro/SSA自身抗原系统中60KD组分的方法。方法从猪脾提取ENA(可提取核抗原),以硫酸铵沉淀结合离子交换层析分离ENA蛋白组分,并用对流免疫电泳检测60KDSSA抗原的活性,以得到纯化60KDSSA抗原的具体条件。结果60KDSSA抗原在Tris-HCl缓冲液(pH8.3)中的硫酸铵沉淀范围是硫酸铵饱和度50%～60%。60KDSSA抗原在50mMTris-HCl缓冲液(pH8.3)+NaCl中的DE52离子交换层析洗脱范围为电导值35～40ms/cm。结论结合硫酸铵沉淀和DE52离子交换层析两种纯化方法所得的60KDSSA抗原相对于其它ENA有较高的纯度,并能有效分离中SSA中60KD、52KD两个组分。

HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*02基因多态性与抗Ro/SSA抗体阳性pSS易感性的关系分析

目的基于数据库相关数据分析人类白细胞抗原(HLA)-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因多态性与抗Ro/SSA抗体阳性的原发性干燥综合征(pSS)易感性的关系。方法使用计算机检索相关数据库,筛选并收集pSS患者、抗Ro/SSA抗体阳性的pSS患者、抗Ro/SSA抗体阴性的pSS患者以及健康对照人群的HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*02基因多态性资料。使用STATA 16.0(USA)统计软件分析抗Ro/SSA抗体阳性的pSS患者中HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因多态性与pSS发生的关系。结果纳入文献5篇,涉及420例pSS患者、250例抗Ro/SSA抗体阳性pSS患者、120例抗Ro/SSA抗体阴性的pSS患者和733例健康对照者。在pSS患者中,HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因阳性分别为159、246例;在健康对照者中,HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因阳性分别为196、282例;在抗SSA抗体阳性pSS患者中,HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因阳性分别为129、158例;在抗SSA抗体阴性pSS患者中,HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因阳性分别为30、46例。HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因多态性与pSS的易感性有关(I2分别为62.99%、40.75%,合计OR值分别为2.60、2.43,95%CI分别为1.49~4.55、1.88~3.14,P均<0.05)。HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因多态性也与抗Ro/SSA抗体阳性pSS的易感性有关(I2分别为0.00%、9.41%,合计OR值分别为3.85、2.61,95%CI分别为1.81~8.21、1.52~4.48,P均<0.05)。结论HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因多态性与抗Ro/SSA抗体阳性的pSS患者的易感性相关。具有HLA-DQA1*0501和HLA-DQB1*02基因阳性的抗Ro/SSA抗体阳性患者更容易患pSS。

新生儿红斑狼疮与抗Ro/SSA和抗La/SSB抗体阳性2例

报告了 2例新生儿红斑狼疮。 1例出生后发现有心脏房室传导阻滞和室间隔缺损 ,脐血检测有抗Ro/SSA和抗U1RNP抗体 ,母亲为SLE患者。 1例出生后 1个月于面部、颈部及躯干上部出现环形红斑样皮疹 ,脐血检测有抗Ro/SSA和抗La/SSB抗体 ,母亲为SCLE患者。 2例患儿皮疹和心脏传导阻滞于生后 3个月内消退 ,自身抗体于生后 6个月内消退 ,随访 7年和 1 5年后均健康。

自身抗原52 kD-Ro/SSA的序列分析及抗原性预测

目的：分析自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的序列结构，预测其抗原位点。方法：将自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的氨基酸序列输入“蛋白质结构预测”软件包，分析蛋白质分子亲水性、表面可及性、柔性，并模拟其二级结构，预测其主要抗原位点。结果：自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ是多抗原位点，其氨基酸序列中１２０～１３０、３００～３２０、３６０～３８０位间抗原性较强。结论：确定５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的抗原优势表位，为研究抗原抗体间相互作用及其疾病机制打下基础。

表达人自身抗原SSA/Ro60重组体的构建及鉴定

目的 :构建表达人自身抗原SSA/Ro6 0的重组体 ,为研究自身免疫病中的抗原抗体作用提供物质基础。方法 :采用逆转录 PCR技术克隆自身抗原SSA/Ro6 0cDNA ,定向插入表达载体PGEX 2T ,并经酶切电泳 ,DNA测序鉴定分析。结果 :经鉴定 ,证明成功构建了表达人自身抗原SSA/Ro6 0的重组体。结论 :SSA/Ro6 0表达型重组体可用于自身抗原SSA/Ro6 0的大量生产并用于诊断。

自身抗原SSA/Ro-52kD抗原优势表位分析

探讨自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ的抗原优势表位，为疾病机制的研究提供依据，根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析。采用ＰＣＲ法克隆自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ多肽片段的ｃＤＮＡ，定向插入表达载体ＰＧＥＸ－５Ｘ－１，并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白，用ＧＳＴ亲和层析柱进行纯化，经免疫印迹法与病人阳性血清进行反应，结果表明片段Ｒｏ５２３具有较强的抗原性。

ANA、SSA、SSB、RO-52在干燥综合征诊断中的临床意义

目的探讨干燥综合征(SS)患者ANA、SSA、SSB和RO-52抗体检测的临床意义。方法选取2010年5月至2012年5月南昌大学第二附属医院住院及门诊SS患者49例和非SS患者144例及40例健康对照体检者,采用间接免疫荧光法测ANA;免疫印迹法测抗SSA、SSB和RO-52抗体,并对结果进行回顾性分析。结果 (1)三组ANA、SSA、SSB、RO-52阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01);(2)SS组ANA与SSB、RO-52阳性率(P<0.01)和SSA与RO-52阳性率(P<0.05)比较差异有统计学意义,SLE组除SSA与RO-52外其余阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01),MCTD组SSA与SSB、RO-52阳性率(P<0.01)和SSA与SSB阳性率(P<0.05)比较差异有统计学意义,RA组ANA与RO-52阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01),各组其余阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05);(3)SS组SSA/SSB与SSA/SSB/RO-52阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05),SLE组SSA/RO-52与其余各项阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01),MCTD组SSA/RO-52与其余各项阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05);(4)在SS患者抗体检测中ANA的敏感性高但特异性差,SSA、SSB、RO-52敏感性稍低但特异性高。结论 SS患者检测ANA及抗SSA、SSB和RO-52抗体等自身抗体,对SS的诊断、鉴别诊断具有重要的作用,可提高SS的诊疗水平。

自身抗原60 kd-Ro/SSA序列分析及抗原性预测

抗自身抗原Ｒｏ／ＳＳＡ的自身抗体出现于系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）、干燥综合征（ＳＳ）等自身免疫病患者血清中，可能参与疾病的发病机制。我们已克隆获得６０ｋｄ－Ｒｏ／ＳＳＡ的基因，并在体外培养中得到表达［１］。我们应用蛋白质数据库与序列分析软件程序包，分析...

抗SSA、抗SSB、抗Ro52抗体在自身免疫性疾病中的临床价值探讨

目的研究抗SSA、抗SSB和抗Ro52抗体在自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AID)诊断中的临床意义,探讨在SLE、SS、RA中相关实验室项目结果在抗SSA/SSB/Ro52抗体的单阳性组和多阳性组间是否存在差异。方法选取抗SSA/SSB/Ro52抗体结果为阳性的患者,分析他们的相关实验室检测结果与临床最终诊断。结果抗SSA/SSB/Ro52抗体不同阳性组合之间AID和非AID诊断的构成比具有显著差异,并且随着抗体阳性的增多AID所占的百分比也随着增加,各组百分比按大小排列为SSA+SSB+Ro52+>SSA+SSB+/SSA+Ro52+/SSB+R052+>SSA+/SSB+/Ro52+;SLE患者Ig G的升高、RA淋巴细胞的降低、SS患者球蛋白Ig G的升高以及C3的降低在单阳性组与多阳性组间有显著差异。结论抗SSA、抗SSB、抗Ro52抗体可作为AID的筛选指标,阳性抗体越多AID确诊的可能性越大。在SLE、RA、SS患者中,部分实验结果在单阳性组与多阳性组间有显著差异,提示多抗体阳性可能与疾病的活动性或严重程度有关。

抗SSA/Ro抗体的检测方法比较

综合比较了四种检测抗SSA/Ro抗体方法的敏感性、特异性及阳性检出率 ,得出IBT法与ID法相结合是比较实用、又能显著提高检出率的理想方法。

Ro60/SSA基因转染HEp-2细胞作为间接免疫荧光检测底物及其应用

本研究拟改造间接免疫荧光技术(IIF)抗核抗体(ANA)检测法的底物HEp-2细胞,建立抗60kDRo60/SSA抗体免疫荧光检测法。采用PCR扩增人源Ro60 cDNA,克隆入真核表达载体pEGFP-C1,并转染HEp-2细胞。通过荧光显微镜、免疫印迹法(IBT)及IIF鉴定转染细胞(HEp-Ro60)中Ro60-绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达和抗原性。分别以HEp-Ro60以及HEp-2为底物的IIF检测10份抗Ro/SSA对流免疫电泳(CIE)检测阳性、其他抗体阴性血清以及对照血清。获得的转染细胞传十几代后仍具有较强的Ro60-GFP表达,融合蛋白保持Ro60的抗原性。IIF检测中HEp-Ro60的滴度比HEp-2增加了6.7倍(P<0.01),而且2例HEp-2细胞上IIF检测为阴性的血清在HEp-Ro60上为阳性。10例阳性血清中有8例出现了特征性荧光模式。结论是HEp-Ro60可用于IIF检测抗Ro抗体,并增加了ANA检出的敏感性。

自身抗原Ro/SSA抗原优势决定簇分析

目的： 探讨自身抗原Ｒｏ／ＳＳＡ（Ｍｒ＝ ６０ ０００）的抗原决定簇，为自身免疫性疾病机制的研究提供依据。方法： 根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析，采用ＰＣＲ法克隆自身抗原Ｒｏ／ＳＳＡ（Ｍｒ＝ ６０ ０００）多肽片段的ｃＤＮＡ，定向插入表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ，并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白，用ＧＳＴ亲和层析柱进行纯化，经免疫印迹法与患者阳性血清进行反应。结果： Ｒｏ／ＳＳＡ（Ｍｒ＝ ６０ ０００）的抗原优势决定簇主要存在于１００～１９０位和１９１～３００位，不同患者、不同病程抗原优势决定簇有所不同。结论：抗原驱动机制在自身免疫性疾病的发病中起重要作用。

红斑狼疮皮损内角质形成细胞凋亡和SSA/Ro抗原的表达

目的 :探索光敏感红斑狼疮 (LE)皮损形成的机理和SSA/Ro抗原表达的来源。方法 :用原位切口标记法和免疫荧光法测定了 1 9例光敏感型红斑狼疮 (LE)患者新鲜皮损内自身抗原SSA/Ro表达情况和角质形成细胞凋亡情况。结果 :发现 7例LE皮损表皮内棘细胞周围有不同程度的颗粒状SSA/Ro抗原表达 ;而对照组无 1例荧光着色 ,1 3例皮损表皮棘细胞内可见凋亡细胞荧光着色。结论 :光敏感LE患者的角质形成细胞通过细胞凋亡释放SSA/Ro抗原 ,并参与皮损形成。

线性免疫印迹法检测抗60 kD Ro/SSA IgG抗体的对比分析

目的评价5个不同厂家自身抗体谱线性免疫印迹法(LIA)试剂中的抗60 k D Ro/SSA Ig G抗体项目的一致性及符合率。方法收集本院54例自身免疫性疾病病人和10份2013年卫生部临检中心室间质评血清及30例健康人血清,同时使用酶联免疫吸附(ELISA)法和5个不同品牌LIA法试剂对血清中的抗60 k D Ro/SSA Ig G抗体进行检测,比较5个不同品牌LIA法试剂检测60 k D Ro/SSA Ig G抗体的一致性及总体符合率。结果 ELISA法试剂盒检测94例血清中阳性标本37例,阴性标本57例,同时进行的5种不同品牌LIA法抗核抗体谱试剂检测抗60 k D Ro/SSA Ig G抗体结果的总体符合率均超过90%,吻合系数均>0.8,说明一致性很好,但5种品牌均出现不相一致的阳性和阴性。结论 LIA法的抗核抗体谱检测试剂盒在检测抗60 k D Ro/SSA Ig G抗体项目中一致性很好,但检测结果可疑时应使用天然抗原包被的ELISA法试剂或双向扩散法进行复测。

SSA/Ro60自身抗原的基因克隆与表达纯化

目的 克隆人SSA/Ro60自身抗原并表达纯化,为辅助诊断自身免疫提供物质基础。方法 采用RT-PCR技术扩增SSA/Ro60基因,定向插入pPICZ表达载体,转入毕赤酵母表达系统,将获得的重组蛋白行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果 扩增出约1.5kb的SSA/Ro60全长序列,获得相对分子质量60×103的重组蛋白,经鉴定具有SSA/Ro60抗原性。结论成功克隆并表达SSA/Ro60,为诊断自身免疫疾病奠定基础。

敲低Ro60/SSA表达对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响

目的:探讨下调Ro60/SSA的表达对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响。方法:将人肝癌细胞HAK-1A和HepG2分别分3组处理:空白对照组常规培养(DMEM培养基+体积分数10%胎牛血清);另两组脂质体法分别转染siRNA-NC和siRNA-Ro60/SSA,每组设置3个复孔。转染48 h后应用Western blot法检测细胞中Ro60/SSA蛋白的表达,应用克隆形成实验和球形形成实验检测细胞的自我更新和增殖能力;应用Transwell小室法检测3组HAK-1A细胞的迁移和侵袭能力。将雌性BALB/c裸鼠随机分为siRNA-NC组和siRNA-Ro60/SSA组,每组5只。将转染siRNA-NC或siRNA-Ro60/SSA的HAK-1A细胞以1×10^(4)个/μL尾静脉注射入裸鼠体内(200μL/只),4周后,计数肺部肿瘤灶数量。结果:与空白对照组和siRNA-NC组比较,siRNA-Ro60/SSA组HAK-1A和HepG2细胞Ro60/SSA蛋白表达下调,克隆形成数、成球率均降低(P<0.05)。siRNA-Ro60/SSA组HAK-1A细胞Transwell实验中的迁移细胞数和侵袭细胞数低于空白对照组和siRNA-NC组(P<0.05)。siRNA-Ro60/SSA组裸鼠肺部移植瘤数量低于siRNA-NC组(P<0.05)。结论:敲低Ro60/SSA可明显抑制肝癌细胞的侵袭和转移能力。

免疫印迹技术检测抗Ro/SSA抗体的初步应用(摘要)

抗Ro/SSA抗体是干燥综合征及系统性红斑狼疮(SLE)的重要自身抗体之一。近年来国外已发展了不少高敏感性的检测抗Ro/SSA抗体的方法,国内仍多采用免疫双向扩散或对流免疫电泳(CIE)法检测,敏感性相对较差。

利用重组抗原检测抗SSA/Ro-52kD自身抗体及其临床意义

目的重组表达 SSA/ Ro- 5 2 k D融合蛋白 ,并用于检测自身抗体。方法应用 DNA重组技术构建 SSA/Ro- 5 2 k D工程菌 ,并表达 SSA/ Ro- 5 2 k D融合蛋白。经谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)柱层析纯化后 ,作为抗原 ,分别用免疫印迹法 (IBT)和酶联免疫吸附试验 (EL ISA)检测 2 0份 SS患者血清、6 0份 SL E患者血清和 30份正常人血清。结果重组抗原检测抗 SSA/ Ro- 5 2 k D自身抗体敏感性较高 ,而且抗体滴度与病程相关。结论利用重组抗原对自身抗体进行定性。

通过慢病毒载体构建SSA/Ro52稳定基因沉默细胞系

目的利用慢病毒载体持续表达RNA干扰序列抑制基因表达,建立SSA/Ro52稳定基因沉默细胞系,为进一步研究SSA/Ro52的功能提供有效工具。方法 4条SSA/Ro52特异序列(克隆1为TGGCATGGTCTCCTTCTACAA,克隆2为CTGCCTTCTTTATGGGACTTA,克隆9为TGAG从GTTGGAAGTGGAAAT,克隆1 1为AGTTATCCTATGGTCCTGGGT)和无关对照序列克隆至慢病毒载体pLKO-puro,表达后可形成小发卡结RNA(small hair-pin,shRNA),通过RNA干扰机制抑制特异基因表达。表达SSA/Ro52特异序列的克隆1、2、9、11以及表达无关序列的对照克隆(scramble,S)分别与包装载体pGag-Pol和pVSV-G共同转染293T细胞,收集含病毒颗粒的培养液。用表达SSA/Ro52特异序列和无关对照序列的病毒颗粒感染Hela细胞,抗生素筛选,建立稳定细胞系。以GAPDH为内对照定量实时PCR检测SSA/Ro52 mRNA的表达。免疫印记检测SSA/Ro52蛋白,扫描SSA/Ro52条带与β-actin条带相比为SSA/Ro52蛋白的相对表达水平。克隆1、2、9、11转染细胞中SSA/Ro52的表达水平与对照克隆S的比值为基因表达的抑制程度。结果慢病毒颗粒可以有效感染Hela细胞,含shRNA表达框架的病毒序列可以整合至细胞基因组,形成稳定细胞系。克隆1、2、9、1 1转染细胞在抗生素筛选3 d后,其SSA/Ro52 mRNA表达水平分别是克隆S转染细胞的25.5%、31.2%、13.0%和77.2%;而上述克隆转染细胞SSA/Ro52蛋白表达水平是对照的5%、50%、10%和80%。培养4周后上述克隆SSA/Ro52蛋白表达水平没有明显变化。但用干扰素α刺激细胞后,SSA/Ro52在对照克隆转染细胞中表达增加,而克隆1、2、9、11转染细胞SSA/Ro52的表达是对照的30%、70%、5%和100%。结论克隆1、2、9可以有效抑制SSA/Ro52的表达,通过慢病毒载体转染细胞建立了SSA/Ro52稳定基因静默细胞系。在SSA/Ro52表达被上调时,克隆9仍然可以有效抑制SSA/Ro52的表达,为进一步研究SSA/Ro52的功能打下了基础。