抗Ro52抗体和抗Ro60抗体在结缔组织病中的临床价值分析

目的探讨抗Ro52抗体和抗Ro60抗体在结缔组织病(connective tissue disease,CTD)中的临床意义,分析其对结缔组织病相关间质性肺病(CTD associated interstitial lung disease,CTD-ILD)的风险预测价值。方法纳入2019年10月至2021年1月在河北医科大学第二医院风湿免疫科住院并明确诊断为CTD的患者785例,并收集其临床资料。依据患者抗Ro52抗体和抗Ro60抗体的表达情况分为4组:Ro52^(+)Ro60^(-)组(n=94)、Ro52^(-)Ro60^(+)组(n=80)、Ro52^(+)Ro60^(+)组(n=251)和Ro52^(-)Ro60^(-)组(n=360);依据有无ILD将患者分为两组:CTD合并ILD组(n=243)和CTD不合并ILD组(n=542)。比较各组临床资料差异,采用logistic逐步回归进行多因素分析,评估抗Ro52抗体和抗Ro60抗体对CTD,尤其CTD-ILD的临床风险评估。结果患者抗Ro52抗体和抗Ro60抗体表达情况存在差异,不同组别间一般资料、临床症状、细胞因子、免疫球蛋白、补体和自身抗体方面差异均有统计学意义(P<0.05)。男性发生ILD的概率增加了56.7%;年龄每增加1岁,发生ILD的风险将增加3.8%;抗Ro52^(+)Ro60^(-)抗体的CTD患者比其他患者发生ILD的概率高。结论抗Ro52抗体阳性、男性和高龄是CTD患者发生ILD的独立危险因素。抗Ro52和抗Ro60抗体在CTD中作用复杂,应该替代传统的抗SSA抗体分别做为独立的抗体来进行检测。

Transfection,overexpression and clinical application of human 60 kDa Ro/SSA autoantigens in HEp-2 cells

Objective To develop an improved substrate for indirect immunofluorescence test (IIF) for detecting anti-Ro60/Sjogren's syndrome A (Ro/SSA) autoantibodies.Methods 60-kDa Ro/SSA autoantigens (Ro60) cDNAs were obtained from human placental cDNA library using polymerase chain reaction (PCR) and were cloned into the mammalian expression vector-pEGFP-C1. Then, the recombinant plasmids were transfected into HEp-2 cells. We confirmed the overexpression, localization and antigenicity of fusion proteins in transfected cells by means of immunoblotting, confocal fluorescence microscopy and IIF. HEp-2 and HEp-Ro60 were analyzed by IIF using a panel of 10 precipitin-positive anti-Ro human sera simultaneously.Results Stable expression of Ro60-green fluorescent protein (Ro60-GFP) fusion proteins were maintained ten more generations. Ro60-GFP kept the antigenicity of Ro while demonstrating its own characteristic immunofluorescent pattern in HEp-Ro60 cells. The transfectants dramatically increased the sensitivity of IIF testing (a mean increase of 6.7-fold in endpoint titer). Eight overten (8/10) positive anti-Ro sera showed characteristic immunofluorescent patterns for HEp-Ro60, including two sera that were anti-nuclear antibodies (ANA) negative for untransfected HEp-2. IIF-ANA in all healthy sera was negative for HEp-Ro60. Conclusions As a new substrate for IIF, the Ro60 transfectants can be used to detect anti-Ro antibodies. In addition, transfected HEp-2 cells keep the immunofluorescent properties of HEp-2 cells in IIF-ANA tests and can be employed as a substrate for routine IIF-ANA detection.

自身抗原Ro-60 cDNA克隆构建及表达

目的：采用基因工程方法克隆并表达自身抗原Ｒｏ－６０融合蛋白。方法：用ＰＣＲ法克隆Ｒｏ－６０多肽分子的ｃＤＮＡ，经测序证实后定向插入表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，并经酶切电泳鉴定。进而导入大肠杆菌ＪＭ１０９中表达重组融合蛋白。结果：经蛋白印迹证实，重组融合蛋白具有Ｒｏ抗原性。结论：重组融合蛋白可用于对Ｒｏ抗原表位的精确定位，分析特定抗原表位与疾病的相关性及制备重组抗原用于临床检测。

ROS在齐墩果酸诱导HL-60细胞凋亡中的作用

目的观察ROS在齐墩果酸(OA)诱导HL-60细胞凋亡中的作用。方法分瓶培养细胞,实验设空白对照组和12、24、48 h的OA用药组。收集细胞,提取细胞总蛋白,制备去线粒体细胞浆蛋白,Western印迹法检测caspase-9表达。流式细胞术检测ROS水平。结果 OA处理HL-60细胞后,ROS含量增加,并引起caspase-9的激活。结论 OA使ROS量增加,通过线粒体凋亡信号通路诱导HL-60细胞凋亡。

Ss-A/Ro核蛋白60 ku亚单位在胃癌多药耐药中的作用

目的:对Ro 60在胃癌多药耐药中的功能进行研究．方法:克隆Ro 60编码基因,构建Ro 60编码基因的正义真核表达载体,将其转导入SGC7901 细胞,应用半定量RT-PCR技术,对基因转染细胞进行鉴定,通过MTT法进行体外药物敏感性分析,借助流式细胞仪检测细胞内蓄积的阿霉素．结果:成功构建了Ro 60正义真核表达载体, 应用脂质体介导法将其转导入SGC7901,Ro 60真核表达载体转染SGC7901细胞后其表达量明显增加,体外药物敏感性试验提示其对长春新碱、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、顺铂、阿霉素的敏感性减低,SGC7901细胞的IC50值 (mg/L)与未转染细胞和转染空白载体细胞相比,显著增加(2．28±0．11 vs 0．45±0．04,0．65 ±0．05;2．89±0．14 vs 0．61±0．21,0．90±0．11; 1．92±0．03 vs 0．54±0．03,0．75±0．21;1．41± 0．06 vs 0．45±0．03,0．54±0．03;0．28±0．03 vs 0．14±0．01,0．14±0．01;均P<0．01),细胞内阿霉素蓄积显著减少(56．30±2．49 mg/L vs 92．83 ±3．63,87．38±2．94 mg/L,P<0．01)．结论:Ro 60真核表达载体转染SGC7901细胞后显示了一些多药耐药的特性,提示Ro 60在胃癌多药耐药中发挥了一定的作用．

Ss-A／Ro核蛋白60 ku亚单位及其变异体在耐药胃癌细胞中的表达

目的:克隆Ss-A／Ro 60 ku亚单位编码基因,检测Ss-A／Ro 60 ku亚单位及其变异体在耐药胃癌细胞中的表达情况．方法:应用RT-PCR克隆Ss-A／Ro 60 ku亚单位编码基因,应用半定量RT-PCR检测Ss-A／Ro 60 ku亚单位及其变异体在胃癌细胞中的表达情况．结果:成功克隆了Ss-A／Ro 60 ku亚单位编码基因,并发现了他的两种变异体,长度分别为52 bp和41 bp．半定量RT- PCR结果显示,Ss-A／Ro 60 ku亚单位在SGC7901／VCR中的表达强度高于SGC7901细胞(P=0．0001),Ss-A／Ro 60 ku亚单位的两种变异体在SGC7901／VCR中的表达强度也高于 SGC7901细胞(P=0．001)．结论:Ss-A／Ro 60 ku亚单位及其两种变异体为胃癌多药耐药相关分子．

表达人自身抗原SSA/Ro60重组体的构建及鉴定

目的 :构建表达人自身抗原SSA/Ro6 0的重组体 ,为研究自身免疫病中的抗原抗体作用提供物质基础。方法 :采用逆转录 PCR技术克隆自身抗原SSA/Ro6 0cDNA ,定向插入表达载体PGEX 2T ,并经酶切电泳 ,DNA测序鉴定分析。结果 :经鉴定 ,证明成功构建了表达人自身抗原SSA/Ro6 0的重组体。结论 :SSA/Ro6 0表达型重组体可用于自身抗原SSA/Ro6 0的大量生产并用于诊断。

Ss-A/Ro核蛋白60 ku亚单位反义核酸逆转胃癌细胞多药耐药

目的:对Ro 60反义核酸在逆转胃癌细胞多药耐药中作用进行研究．方法:克隆Ro 60编码基因,构建Ro 60编码基因的反义真核表达载体,将其转导入SGC7901细胞,应用半定量RT-PCR技术,对基因转染细胞进行鉴定,通过MTT法进行体外药物敏感性分析,借助流式细胞仪检测细胞内蓄积的阿霉素．结果:成功构建了Ro 60反义真核表达载体,应用脂质体介导法将其转导入SGC7901-VCR, Ro 60反义真核表达载体转染SGC7901-VCR细胞后,Ro 60的表达量明显下降,体外药物敏感性实验提示其对长春新碱、丝裂霉素、顺铂、阿霉素的敏感性增加,转染反义表达载体的SGC7901-VCR细胞与未转染和转染空载体的细胞相比,IC50值(mg/L)有显著的下降(7．66±0．45 vs 19．56±0．38,17．48±0．85;0．84±0．03 vs 1．62±0．06．1．80±0．03;0．51±0．03 vs 0．87±0．03．0．88±0．03;0．22±0．01 vs 0．52±0．02,0．43±0．03,均P<0．01),细胞内阿霉素蓄积有显著的增加(51．94±1．26 mg／L vs 36．27±0．98,37．01±0．91 mg／L,P<0．01)．结论:Ro 60反义真核表达载体转染SGC7901后能够抑制胃癌细胞的多药耐药表型．

三氧化二砷诱导HL-60细胞凋亡过程中ROS、NF-κB和C-IAP2的变化

背景与目的:探讨As2O3(arsenic trioxide,ATO)对HL-60细胞凋亡过程中细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、NF-κB(nuclear factor kappa B),及C-IAP2(cellular inhibitor of apoptosis proteins 2)的影响。材料与方法:以7.5μmol/L As2O3单独应用及与500μmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)联合作用于HL-60细胞12、24 h后,流式细胞术检测HL-60细胞ROS的产生量;Western blot法检测NF-κB P65核蛋白的变化情况;半定量RT-PCR法检测C-IAP2的相对表达量。结果:7.5μmol/L的As2O3作用HL-60细胞12、24 h后细胞内ROS的生成增加,与阴性对照比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。NF-κBP65核蛋白的相对含量分别为49.3%±4.4%和23.1%±2.1%,C-IAP2的相对表达分别为72.9%±5.8%和59.3%±4.4%,较对照组均明显降低(P<0.05)。500μmol/L NAC和7.5μmol/L As2O3共同作用HL-60细胞12、24 h后细胞ROS生成量相对减少,与AS2O3单独作用组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);NF-κB P65核蛋白的相对含量分别为65.4%±4.9%和37.1%±3.4%,C-IAP2的相对表达量分别为81.1%±5.8%和73.7%±4.9%。较AS2O3单独作用组均明显增加(P<0.05)。结论:As2O3诱导HL-60细胞凋亡过程中,细胞内ROS生成增加,抑制NF-κB活性,同时下调其靶基因C-IAP2等的表达;NAC能阻断As2O3诱导HL-60细胞凋亡过程中ROS的生成,部分阻断了NF-κB活性的抑制。

Ss-A/Ro 60 ku亚单位变异体1在胃癌多药耐药中的作用

目的:对Ro 60变异体1在胃癌多药耐药中的功能进行研究.方法:克隆Ro 60变异体1编码基因,构建Ro 60变异体1编码基因的正义真核表达载体,将其转导入SGC7901细胞,应用半定量RT-PCR技术,对基因转染细胞进行鉴定,通过MTT法进行体外药物敏感性分析,借助流式细胞仪检测细胞内蓄积的阿霉素.结果:成功构建Ro 60变异体1正义真核表达载体:应用脂质体介导法将其转导入SGC7901,其表达量明显增加;体外药物敏感性试验提示,与SGC7901和SGC7901-pcDNA3.1细胞相比,转染细胞对长春新碱(IC_(50):2.87±0.10 mg/L vs 0.47±0.07 mg/L,0.63±0.08 mg/L,P<0.01)、5-氟尿嘧啶(IC_(50):3.89±0.12 mg/L vs 0.59±0.17 mg/L,0.92±0.12 mg/L,P<0.01)、丝裂霉素(IC_(50):1.02±0.06 mg/L vs 0.50±0.04 mg/L,0.73±0.09 mg/L,P<0.05)、顺铂(IC_(50):1.15±0.06 mg/L vs 0.46±0.04 mg/L.0.52±0.05 mg/L,P<0.01)、阿霉素(IC_(50):0.45±0.03 mg/L vs 0.15±0.03 mg/L,0.16±0.02 mg/L,P<0.01)的敏感性减低;流式细胞仪检测结果显示,转染细胞内阿霉素的蓄积减少(50.39±2.09 mg/L vs 94.99±4.07 mg/L,88.06±2.67 mg/L,P<0.01).结论:Ro 60变异体1真核表达载体转染SGC7901细胞后,显示多药耐药特性.

SSA/Ro60自身抗原的基因克隆与表达纯化

目的 克隆人SSA/Ro60自身抗原并表达纯化,为辅助诊断自身免疫提供物质基础。方法 采用RT-PCR技术扩增SSA/Ro60基因,定向插入pPICZ表达载体,转入毕赤酵母表达系统,将获得的重组蛋白行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果 扩增出约1.5kb的SSA/Ro60全长序列,获得相对分子质量60×103的重组蛋白,经鉴定具有SSA/Ro60抗原性。结论成功克隆并表达SSA/Ro60,为诊断自身免疫疾病奠定基础。

敲低Ro60/SSA表达对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响

目的:探讨下调Ro60/SSA的表达对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响。方法:将人肝癌细胞HAK-1A和HepG2分别分3组处理:空白对照组常规培养(DMEM培养基+体积分数10%胎牛血清);另两组脂质体法分别转染siRNA-NC和siRNA-Ro60/SSA,每组设置3个复孔。转染48 h后应用Western blot法检测细胞中Ro60/SSA蛋白的表达,应用克隆形成实验和球形形成实验检测细胞的自我更新和增殖能力;应用Transwell小室法检测3组HAK-1A细胞的迁移和侵袭能力。将雌性BALB/c裸鼠随机分为siRNA-NC组和siRNA-Ro60/SSA组,每组5只。将转染siRNA-NC或siRNA-Ro60/SSA的HAK-1A细胞以1×10^(4)个/μL尾静脉注射入裸鼠体内(200μL/只),4周后,计数肺部肿瘤灶数量。结果:与空白对照组和siRNA-NC组比较,siRNA-Ro60/SSA组HAK-1A和HepG2细胞Ro60/SSA蛋白表达下调,克隆形成数、成球率均降低(P<0.05)。siRNA-Ro60/SSA组HAK-1A细胞Transwell实验中的迁移细胞数和侵袭细胞数低于空白对照组和siRNA-NC组(P<0.05)。siRNA-Ro60/SSA组裸鼠肺部移植瘤数量低于siRNA-NC组(P<0.05)。结论:敲低Ro60/SSA可明显抑制肝癌细胞的侵袭和转移能力。

亲和层析法纯化系统性红斑狼疮特异性60KDRo/SSA抗原

目的:建立亲和层析法纯化Ro/SSA自身抗原系统中60KD组分的方法。方法:从猪脾提ENA(可提取核抗原),以硫酸铵沉淀、离子交换层析进行初步纯化。挑选单纯抗60KDSSA抗体阳性的病人的血清,制备亲和层析柱。用ELISA法检测所制备的抗原。结果: 60KDSSA抗体阳性标准血清ELISA检测为阳性,Sm和RNP、Jo-1、Scl-70的标准抗血清为阴性。结论:该方法可获得高纯度的抗原,可用于ELISA检测等目的。

系统性红斑狼疮特异性抗原60KD Ro/SSA的提取和纯化

目的建立从猪脾纯化Ro/SSA自身抗原系统中60KD组分的方法。方法从猪脾提取ENA(可提取核抗原),以硫酸铵沉淀结合离子交换层析分离ENA蛋白组分,并用对流免疫电泳检测60KDSSA抗原的活性,以得到纯化60KDSSA抗原的具体条件。结果60KDSSA抗原在Tris-HCl缓冲液(pH8.3)中的硫酸铵沉淀范围是硫酸铵饱和度50%～60%。60KDSSA抗原在50mMTris-HCl缓冲液(pH8.3)+NaCl中的DE52离子交换层析洗脱范围为电导值35～40ms/cm。结论结合硫酸铵沉淀和DE52离子交换层析两种纯化方法所得的60KDSSA抗原相对于其它ENA有较高的纯度,并能有效分离中SSA中60KD、52KD两个组分。

人自身抗原SSA/Ro60的基因克隆和原核表达

目的:克隆并表达人自身抗原SSA/Ro60。方法:应用RT-PCR技术,从HL-60细胞株中克隆人自身抗原SSA/Ro60全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western blot。结果:PCR产物约为1.6 kb,与预期1614 bp接近,测序结果与Genebank报道的完全一致。pGEX-5T-SSA/Ro60重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白分子量为86 KD,具有天然人自身抗原SSA/Ro60的免疫原性。结论:成功克隆表达人自身抗原SSA/Ro60,为下一步工作奠定了基础。

Ro60不同表位自身抗体在SLE和pSS淋巴细胞减少中的作用

目的初步探讨Ro60不同表位自身抗体在系统性红斑狼疮(SLE)和原发性干燥综合征(pSS)患者淋巴细胞(LC)减少中的作用。方法 SLE患者16例,pSS患者14例,均为女性,所有患者病情处于活动期,3个月内未接受过糖皮质激素和免疫抑制剂治疗,Ro60抗体阳性,周围血淋巴细胞低于1×109/L,SLE和pSS组LC计数分别为(0.66±0.12)×109/L和(0.70±0.16)×109/L(P=0.511),另选择健康对照者10例。体外培养3组患者的外周血LC,加入Ro60抗原3个不同表位(aa482-493、aa310-323和aa230-241)的免疫毒素(IT)(AE1、AE2和AE3),MTT法分别检测其对患者LC的毒性,分析患者不同表位IT的细胞毒性与LC计数的关系,同时比较检测2组患者周围血相应表位的自身抗体。结果 3个IT对体外培养的对照组LC均有一定毒性,但AE3和AE2分别对SLE和pSS患者的LC表现有显著增强的细胞毒性,且与患者的淋巴细胞减少程度显著相关(SLE组r=0.653,P=0.06;pSS组r=0.594,P=0.025),两组患者的周围血中3个相应表位的自身抗体阳性率并无显著差异。结论 Ro60自身抗体在SLE和pSS患者LC减少中可能发挥作用,但在两种疾病中其作用机制可能不完全相同。

原发性干燥综合征自身抗体谱阳性率比较及ANA、Ro60、SSB、Ro52及唇腺活检联合检测的意义

目的探讨ANA、唇腺组织活检及Ro60、SSB、Ro52等自身抗体的联合检测在原发性干燥综合征(SS)诊断中的意义。方法收集SS患者105例(SS组),同期健康人群110例(健康组),比较两组ANA及各项自身抗体的水平,比较SS组ANA、Ro60、SSB、Ro52及唇腺组织活检联合检测的检出率。结果与健康组相比,SS组ANA及自身抗体Ro60、SSB、Ro52、CENP-B、M2及n RNP/Sm的阳性率更高,其中ANA及自身抗体Ro60、SSB及Ro52差异最为显著(均P<0.05)。联合检测ANA、自身抗体及唇腺活检的阳性率均高于单项检测(均P<0.05)。结论相对其他自身抗体,Ro60、SSB、Ro52对SS的特异性较高;联合检测ANA、自身抗体及唇腺活检可以提高SS的检出率。

Wangzaozin A调节NADPH氧化酶源性活性氧诱导HL-60细胞分化

利用台盼蓝排染法、吉姆萨染色及流式细胞术对对映-贝壳杉烷二萜wangzaozin A影响人早幼粒白血病细胞HL-60生长、细胞形态、NBT还原能力、细胞吞噬及细胞表面抗原CD11b表达进行了检测.结果显示,0.2~0.8μmol/L wangzaozin A抑制HL-60细胞生长,0.6和0.8μmol/L处理组细胞显示了明显的G1期周期阻滞.随着wangzaozin A浓度升高及处理时间延长,细胞核质比减小,肾形核、杆状核和分叶核细胞增多及胞质中颗粒状物质增加;同时,细胞NBT还原能力、吞噬能力及细胞表面抗原CD11b表达显著增强,表明wangzaozin A可诱导HL-60细胞向成熟粒细胞分化.进一步利用荧光探针DCF检测显示0.6和0.8μmol/L wangzaozin A处理细胞12h后细胞内ROS显著升高;抗氧化剂NAC及NADPH氧化酶抑制剂APO显著抑制wangzaozin A诱导HL-60细胞上调CD11b表达,表明wangzaozin A可通过上调NADPH氧化酶源性的活性氧浓度诱导HL-60细胞分化.

自身抗原52 kD-Ro/SSA的序列分析及抗原性预测

目的：分析自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的序列结构，预测其抗原位点。方法：将自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的氨基酸序列输入“蛋白质结构预测”软件包，分析蛋白质分子亲水性、表面可及性、柔性，并模拟其二级结构，预测其主要抗原位点。结果：自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ是多抗原位点，其氨基酸序列中１２０～１３０、３００～３２０、３６０～３８０位间抗原性较强。结论：确定５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的抗原优势表位，为研究抗原抗体间相互作用及其疾病机制打下基础。

自身抗原Ro 52 kd多肽分子cDNA表达克隆的构建及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

采用ＰＣＲ法克隆自身抗原Ｒｏ５２ｋｄ多肽分子的ｃＤＮＡ，定向插入表达载体ＰＧＥＸ－４Ｔ－１，并导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白，经免疫印迹法表明，重组融合蛋白具有Ｒｏ５２ｋｄ的抗原性。这为今后对Ｒｏ５２ｋｄ抗原表位的精确定位，分析特定抗原表位与疾病的相关性及制备重组抗原用于临床检测奠定了基础。