金黄色葡萄球菌酚溶调控蛋白α小肽敲除对自溶素AtlA蛋白表达的影响

目的利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌Newman psmα基因缺失突变株,探究psmα缺失对金黄色葡萄球菌蛋白表达的影响。方法分别扩增psmα基因的上下游同源臂,根据同源重组原理,构建p BT2基因打靶载体,利用同源重组技术,构建psmα缺失的Newman突变株。并对野生株和突变株培养上清蛋白进行研究。结果突变株培养上清中一个相对分子质量约为135×103的蛋白表达水平较野生株明显减少甚至缺失;质谱分析提示该蛋白为金黄色葡萄球菌atl A基因编码的双功能自溶素前体蛋白(Atl A蛋白);实时荧光定量PCR结果显示psmα基因敲除株atl A基因的转录水平较野生株显著降低。结论 psmα缺失后能够降低atl A基因的转录表达水平。

肺炎链球菌菌体蛋白LytA和CbpA对感染小鼠的诊断价值

目的通过基因工程技术获取肺炎链球菌自溶素（autolysin，LytA）和胆碱结合蛋白A（choline binding proteinA，CbpA），探讨其对肺炎链球菌感染小鼠的血清学诊断价值。方法根据GenBank中lytA和cbpA基因保守序列设计合成特异性引物，采用PCR技术从肺炎链球菌基因组中扩增lytA和cbpA保守序列片段；经由IPTG诱导并通过等电点洗脱方法获取纯化的重组蛋白LytA和CbpA；Westernblot测定表达蛋白的抗体结合活性。以LytA和CbpA为抗原，建立ELISA反应模式测定感染小鼠血清中相应的IgG和IgM抗体，评价诊断价值。结果成功构建了原核表达载体pET-32a（＋）／lytA和pET-32a（＋）／cbpA，表达的重组蛋白LytA和CbpA具有较好的抗体结合活性。实验组小鼠（肺炎链球菌感染组）IgM和IgG类抗LytA抗体滴度高于对照组（正常对照组和乙型链球菌感染对照组），差异有统计学意义（P〈0．05），CbpA抗体与正常对照组差异有统计学意义，与乙型链球菌感染组差异无统计学意义（P〉0．05）。CbpA蛋白对感染小鼠诊断的敏感性较高（IgG：83．3％；IgM：75．0％），而LytA特异性较高（IgG：100％；IgM：100％）。结论协同利用重组蛋白CbpA诊断敏感性及LvtA的特异性，对肺炎链球菌感染小鼠的血清学诊断具有一定价值，为进一步用于临床检验奠定基础。

金黄色葡萄球菌PGRP的原核表达及生物信息学分析

目的构建金黄色葡萄球菌PGRP基因片段的原核表达,对表达产物进行生物信息学分析。方法根据GenBank中收录的金黄色葡萄自溶素(autolysin,AtlA)基因序列(AC:D17366),设计其中pgrp基因片段的特异性引物,并通过NCBI Blast,在收录的所有金黄色葡萄球菌菌株中对相应的基因序列进行保守性分析。提取金黄色葡萄球菌(ATCC25923)的全基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增pgrp基因序列,构建该基因的克隆载体pEASY-T1/pgrp及表达载体pET-32а(+)/pgrp,通过IPTG诱导表达重组蛋白PGRP。利用生物信息学相关软件(ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1server、Signal-3L、TMpred、DAS、NetPhos 2.0Server)分析rPGRP蛋白的理化性质、信号肽、跨膜域及磷酸化位点等生物学信息。结果成功构建重组质粒pEASY-T1/pgrp及表达载体pET-32а(+)/pgrp,构建的克隆质粒测序结果与GenBank中金黄色葡萄自溶素AtlA基因序列(AC:D17366)的相似性为95.7%。获得的rPGRP分子质量单位约为20×103。生物信息学方法分析rPGRP片段由155个氨基酸组成,分子质量单位(Mr)为17.440 95×103,理论pI为5.45,是一种稳定的亲水性蛋白,该蛋白无信号肽且为非跨膜蛋白,属于胞外蛋白。结论成功构建金黄色葡萄球菌自溶素酰胺酶PGRP的原核表达系统。获得的约20×103肽聚糖识别蛋白片段为稳定的亲水性胞外蛋白。

肺炎链球菌小片段自溶素蛋白LytA′的体外抗菌活性探讨

目的构建肺炎链球菌(ATCC49619)小片段自溶素基因lytA′的原核表达载体,通过大肠埃希菌表达系统进行原核表达获得一种新型肺炎链球菌小片段自溶素重组蛋白LytA′,初步探讨该蛋白的体外抗菌活性,并与青霉素G同时进行比较。方法设计lytA基因的特异性引物,并通过PCR方法从肺炎链球菌(ATCC49619)中扩增lytA基因,并将其插入原核表达载体PGM-T中,构建PGM-T/lytA重组质粒,使用限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ消化PGM-T/lytA获得小片段自溶素基因lytA′。再构建表达质粒pET-32a(+)/lytA′并转化到感受态细胞大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达目的蛋白,使用透析袋等电点洗脱技术纯化回收目的蛋白LytA′;采用微量肉汤稀释法分别测定LytA′和青霉素G对肺炎链球菌(ATCC49619)的最小抑菌浓度(MIC),并将其作用于青霉素G敏感菌株肺炎链球菌(ATCC49619),初步探讨小片段自溶素蛋白LytA′的体外抗菌活性。结果成功构建重组质粒PGM-T/lytA和pET-32a(+)/lytA′。小片段自溶素重组蛋白表达良好,并显示出预期的抗菌活性。与生长对照组相比,LytA′和青霉素G在3 h时显示出明显的抗菌活性(t=14.2430,P<0.0110;t=7.4000,P<0.0220),抑菌效应持续至7 h(t=20.8380,P<0.0080;t=17.8890,P<0.0170),抑菌效应逐渐增强。此外,在7 h时,LytA′的抑菌活性明显强于青霉素G(t=6.7640,P<0.0270)。结论小片段自溶素重组蛋白LytA′对青霉素G敏感肺炎链球菌显示出一定的体外抑菌活性,且持续时间久,有成为抗肺炎链球菌感染治疗药物的可能性。