不同核酸提取方法对HBV-DNA检测性能验证情况分析

目的评估2种乙型肝炎病毒(HBV)-DNA提取方法及2家检测试剂的性能,有助于选择优化提取试剂和检测试剂。方法2023年4月采用达安全自动核酸提取仪提取法(磁珠法)和手工提取法(一步法),并用达安和圣湘2种HBV-DNA试剂检测,对其进行精密度、正确度、线性范围、检出限及抗干扰能力等性能进行验证和评价。结果达安全自动核酸提取仪提取达安试剂检测、手工提取达安试剂检测和手工提取圣湘试剂检测在精密度、正确度、线性范围、检出限方面验证结果均达标;达安全自动核酸提取仪提取圣湘试剂检测在低值检测中变异系数大于5%,最低检测限验证不合格;抗干扰能力方面,全自动核酸提取仪提取的2.0 g/dL血红蛋白浓度的样本用达安和圣湘试剂检测结果均不受影响。手工提取甘油三酯浓度达3000 mg/dL的样本用达安和圣湘试剂检测的结果均不受影响。结论不同厂家的提取和检测试剂避免混用,达安和圣湘试剂对HBV-DNA定量检测的结果均符合要求。

不同的核酸提取方法在布鲁氏菌检测中的应用评价

目的比较不同核酸提取方法对布鲁氏菌检出率的影响,为布鲁氏菌核酸快速提取检测提供技术参考。方法分别使用磁珠法、直接裂解法和高温裂解法对感染布鲁氏菌患者的20例全血样本、10例关节腔及浆膜腔积液样本进行核酸提取,然后进行实时荧光RT-PCR检测,采用SPSS 22.0对结果进行统计分析,评价该核酸快速提取试剂的DNA提取效率。结果磁珠法阳性检出率为100%,Ct值中位数为29.17(21.19~31.33),批内变异系数(CV)最高为1.33%。直接裂解法阳性检出率为63.33%,Ct值中位数为33.29(28.69~34.54),批内CV最高为1.28%。高温裂解法阳性检出率为100%,Ct值中位数为30.26(26.63~33.85),批内CV最高为1.21%。高温裂解法和磁珠法检出率比较差异无统计学意义(P>0.05),直接裂解法检出率显著低于磁珠法和高温裂解法(P<0.05)。结论核酸快速提取试剂在高温裂解条件下可保证核酸提取效率和重复性稳定,具有操作简单、检测时间短、降低实验室生物安全风险等优势,可以应用于布鲁氏菌的核酸检测。

基于微通道多向阀自动化快速提取DNA的研究

核酸的高效分离与纯化对于下游分子诊断具有至关重要的影响.本研究基于磁珠法提取原理设计出快速、自动化核酸提取系统,利用步进电机和注射泵组成的移液装置通过微通道连接多向电磁阀完成核酸裂解、洗涤、洗脱、纯化,通过大鼠主动脉内皮细胞进行核酸提取和扩增,对核酸加热裂解时间进行优化.结果表明,当裂解时间大于4 min时,核酸纯化效果最好,磁珠回收率可达96.5%,紫外吸收光比值大于1.8,同时整个自动化提取仅需8 min.通过微通道多向阀与核酸提取技术纯化后的核酸可直接用于扩增实验,且与手动提取相比聚合酶链式反应的Ct值起跳更早,有利于后续集成核酸检测一体化系统.

磁珠法提取新型冠状病毒核酸的稳定性

目的探索磁珠法提取新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸及其与试剂混合后的稳定性。方法将国家卫生健康委员会临床检验中心(NCCL)和四川省临床检验中心(SPCCL)提供的32份SARS-CoV-2室间质量评价(EQA)样本分为4组,每组含3份NCCL样本和5份SPCCL样本。所有样本均采用磁珠法提取核酸,得到的核酸采用实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法立即检测1次(靶基因为ORF1ab基因和N基因),即为各样本的初始结果。各样本余下的核酸按以下方式处理:第1组和第2组样本的核酸分别于4℃和20℃保存,在第6、12、18、24天各检测1次并记录结果;第3组和第4组样本的核酸与扩增试剂混合组成反应体系,再分别于4℃和20℃保存,在第4、8、16小时各检测1次并记录结果。所有结果用循环阈值(即Ct值)表示。核酸保存后的各次检测结果与其初始结果进行比较。结果磁珠法提取SARS-CoV-2核酸于4℃和20℃保存24 d内各次检测结果与初始结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05);磁珠法提取SARS-CoV-2核酸与扩增试剂混合后,于4℃和20℃保存16 h内各次检测结果与初始结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论4℃或20℃保存条件下,磁珠法提取SARS-CoV-2核酸至少可以稳定24 d,与试剂混合后至少可以稳定16 h。

磁适配体生物传感器

磁珠(magnetic beads,MBs)是具有磁性的微小球形颗粒,在将分析物从复杂基质中分离出来以及固定配体等方面发挥关键作用。为了获得不同的识别及信号输出性能,MBs可以与各种反应基团进行功能化并发挥相应作用。对磁珠的性质、制备方法、功能化改性与搭载适配体的应用等方面进行了全面综述,总结了磁生物传感器所表现出的准确性、及时性、便携性、低成本,及在痕量水平上的信号放大等优势。最后,提出了磁珠潜在的应用挑战和未来方向。

磁珠快速核酸提取法在南美白对虾病原检测中的应用及其性能评价

为实现南美白对虾相关病原核酸快速、便捷提取,并实现原材料国产化,降低成本,建立了一种基于国产磁珠的核酸快速提取方法(以下简称磁珠法).以携带虾肝肠胞虫的南美白对虾为实验样本,通过微流控芯片对3种磁珠提取的核酸进行测试,并对裂解液中盐酸胍浓度及洗涤液2中乙醇浓度进行了优化.通过优选实验确定:奥润磁珠提取效果优于其他两种磁珠;裂解液中盐酸胍的最佳浓度为4 mol·L^(-1);洗涤液2中乙醇的最佳质量分数为75%.在此基础上,分析评价了优化后的磁珠法核酸提取线性范围、灵敏度、精密度、特异性及抗干扰能力等技术性能.结果显示:稀释10^(4)倍后的低浓度病原核酸仍保持较好的扩增效果,变异系数为2.03%,表明建立的磁珠法具有较宽的检测范围,灵敏度高,特异性和抗干扰能力强.本文建立的磁珠法可实现快捷、通用、高纯度、低成本的南美白对虾主要病原的核酸提取.

不同核酸提取方法在HBV DNA荧光定量检测中的比较

目的研究不同核酸提取方法在HBVDNA荧光定量检测中的提取效率、重复性、抗干扰性及对扩增试剂的兼容能力。方法运用两种具有不同启动温度的Taq酶的扩增试剂分别扩增经一步法、煮沸法和磁珠法提取HBVDNA强阳性血清的模板,比较不同提取方法对扩增试剂的兼容能力。采用3种方法提取3份HBVDNA含量不同的标本各10次,进行扩增,比较不同方法的提取效率和重复性;对HBVDNA阳性标本用HBVDNA阴性的黄疸血清和溶血液进行10倍稀释后分别用前述方法提取进行干扰试验。结果 3种提取方法中,磁珠法和煮沸法提取的模板对两种扩增试剂具有良好的兼容性;重复性比较以一步法最佳,磁珠法次之,煮沸法较差;提取效率比较以磁珠法最理想,一步法次之,煮沸法最差;对黄疸和溶血的抗干扰能力以磁珠法最佳,溶血对煮沸法有一定影响,在无5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)校正的情况下,黄疸对一步法影响较大,有5-ROX校正系统分析则可以消除这种影响。结论磁珠法具有良好的重复性和提取效率,对黄疸和溶血有较强抗干扰能力,对扩增试剂的兼容性好,是一种理想的核酸提取方法;相对而言,一步法快捷且重复性更佳。

磁珠核酸提取方法在血浆EBV-DNA实时荧光定量PCR检测中应用的性能评价

目的评价磁珠核酸提取方法在血浆EB病毒DNA(EBV-DNA)实时荧光定量PCR检测中应用的性能。方法采用自动化磁珠法提取核酸,并结合实时荧光定量PCR测定EBV-DNA,利用第三方定值参考物质评价该方法的检测性能。同时选取100例鼻咽癌患者,分别用磁珠法与煮沸法定量检测其血浆EBV-DNA,比较分析两种方法的相关性。结果基于自动化磁珠法的实时荧光定量PCR系统检测EBV-DNA,其低、中、高水平的重复性精密度均<3/5 TEa(TEa=靶值±0.4 lg),中间精密度<4/5 TEa;在5.4×101~5.4×10~5U/mL范围内具有良好的线性;最低检测限约为3.334×10~1U/mL;样本中Hb干扰物浓度低于8.667 g/L,对磁珠法检测结果无明显影响。磁珠法与煮沸法的检测结果呈线性相关,阴阳性符合率为83%。结论采用自动化磁珠核酸提取方法结合实时荧光定量PCR检测血浆EBV-DNA,具备良好的检测性能。

乙肝病毒DNA检测2种不同核酸提取方法的性能验证情况分析

目的:对乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测的2种不同核酸提取方法,即手工法(煮沸法)和全自动核酸提取仪法(磁珠法),在使用相同的检测试剂和核酸扩增仪的条件下进行性能验证,以评价其验证结果。方法:依据《医学实验室质量和能力认可准则》《全国临床检验操作规程》等相关文件,由同一操作人员应用中山达安公司生产的HBV-DNA检测试剂盒和ABI7500实时荧光核酸扩增仪,分别采用手工法和全自动核酸提取仪法提取HBV-DNA进行临床样本的批内精密度、批间精密度、正确度、线性范围性能验证实验。结果:手工法的高值血清批内精密度为2.18%,低值血清批内精密度为3.76%;高值质控品批间精密度为3.29%。全自动核酸提取仪法的高值血清批内精密度为1.78%,低值血清批内精密度为2.44%;高值质控品批间精密度为2.84%。正确度验证分别取浓度为2.0×10^3、2.0×10^4、2.0×10^5、2.0×10^6copies/ml的可溯源标准品进行验证,手工法偏倚分别为-4.88%、-2.51%、-2.46%,-2.12%,全自动核酸提取仪法偏倚分别为-2.37%、-0.95%、0.74%、-1.33%。线性范围验证中,手工法和全自动核酸提取仪法的相关系数分别为0.9660、0.9858,均能满足临床检测的需求。结论:全自动核酸提取仪法较手工法提取核酸有利于简化HBV-DNA提取流程,实现分子生物实验室自动化提取核酸。

磁珠法在120例丙型肝炎病毒核酸定量检测中的应用效果观察

[目的]观察磁珠法在丙型肝炎病毒核酸定量检测中的应用效果.[方法]选择自2018年1月至2020年1月间采集的120例丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒(HCV)血清标本,其中低病毒载量22例,中病毒载量64例,高病毒载量34例,采用提取柱法与磁珠法核酸定量检测,根据浓度1×10^(8)样本梯度稀释结果比较2种核酸定量检测方法的灵敏度和线性范围.[结果]磁珠法HCV核酸定量检测阳性率为70.0%,与提取柱法的66.7%比较差异无统计学意义(P>0.05);22例低病毒载量的HCV血清标本磁珠法检测阳性率为40.9%,明显高于提取柱法的9.1%(χ^(2)=5.9394,P=0.0148);磁珠法灵敏度和线性范围分别为39 U/mL和3.9×(10^(1)~10^(8)),与提取柱法比较差异有统计学意义(P<0.05).[结论]磁珠法与提取柱法在中、高病毒载量的检测中一致性较好,在低病毒载量的检测中磁珠法较提取柱法核酸定量检测的灵敏度更高,线性范围更广.

两种核酸提取方法检测丙肝HCV-RNA定量的比较

目的:比较两种HCV-RNA核酸提取试剂对丙肝RNA病毒定量检测结果的差异,选出符合临床实验室要求的方法。方法:本实验从佛山市第一人民医院Roche全自动核酸分析已检测患者样本中选取浓度梯度分布均匀的阳性标本30例,分别使用中元磁珠法和达安磁珠法两种方法进行核酸提取,同时使用达安手工法进行平行实验,采用实时荧光定量PCR技术进行扩增和产物分析,利用统计学方法评价中元磁珠法和达安磁珠法两种核酸提取方法检测结果的正确度以及与达安手工法检测结果的一致性。结果:两种核酸提取方法检测丙肝HCV-RNA定量结果的正确度均可接受,中元磁珠法与达安手工法的一致性不及达安磁珠法与手工法的一致性好。结论:达安磁珠法正确度及与手工法的一致性更符合临床实验室的要求。

基于磁珠的核酸快速提取和纯化

采用纳米磁珠法对细菌基因组DNA、总RNA和质粒DNA进行提取纯化,并与试剂盒法和Trizol法提取效果进行比较,以期获得核酸最佳提取方法。结果发现,与试剂盒法和Trizol法相比,磁珠法在细菌基因组DNA和RNA提取、PCR产物检测及纯化中效率更高;而在PCR产物回收和质粒DNA的提取中,效率低于试剂盒法,质粒酶切效果与试剂盒法无差异。结果表明,纳米磁珠法相比试剂盒法和Trizol法在核酸提取纯化效果上更佳。

磁珠法和煮沸法核酸提取在HPV-DNA分型中的比较

目的比较基于Pre-NAT全自动核酸提取系统的磁珠法与基于手工的煮沸法核酸提取在人乳头瘤病毒(HPV)-DNA分型中的应用。方法收集96份宫颈脱落细胞标本用于两种DNA提取方法检测结果的比对;利用同一混合阳性标本分装后加入系列水平的血红蛋白(Hb),评价抗Hb干扰能力;收集30份临床棉拭子标本,分析两种方法对皮肤破溃或男性生殖道分泌物DNA的提取效率。结果 96份临床标本,两种方法检测结果一致率为91.7%(88/96);磁珠法内参Globin及HPV各亚型的信号值均显著高于煮沸法(t=8.807、4.676,P<0.05)。Hb水平>17g/L时煮沸法HPV-DNA分型失败,而磁珠法信号值不受Hb干扰。30份棉拭子标本,磁珠法和煮沸法检测成功率均为80.0%,阳性率分别为54.2%、41.7%(P=0.564)。结论相比手工提取的煮沸法,基于Pre-NAT全自动病毒核酸提取系统的磁珠法具有操作简便、规范、通量高等优点。两种方法具有一定可比性,磁珠法核酸提取效率高于煮沸法,且不受Hb干扰,更适于临床应用。

磁珠法核酸自动提取温度控制系统设计

针对自主设计的基于纳米磁珠的自动核酸提取系统设计了温度系统,主要包含系统温度控制算法分析、硬件电路设计及相关软件设计;系统温度采用全加热和在固定频率及占空比PWM波控制下间歇性加热的分段控制,通过实验确定全加热时间及PWM波的占空比,并建立知识库,可以满足使用多种磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取的温度要求;用该系统为河南惠尔纳米科技公司试剂盒中裂解液及洗脱液加热,实验发现,裂解时8个裂解孔的最大温度差异小于6℃,洗脱时8个洗脱孔的最大温度差异小于5℃,均满足核酸提取实验时对温度的要求。

基于全自动核酸提取的荧光定量PCR鉴别羊肉制品真伪

目的建立一种基于自动化的快速核酸提取方法,联合三重实时荧光定量PCR技术,鉴别羊肉制品的真伪。方法分别采用全自动核酸提取法、磁珠手提法与柱提法对不同状态羊肉制品进行核酸提取,比较不同方法的提取时间差异,通过三重实时荧光定量PCR扩增结果评估不同方法的提取效果。以GB/T38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》为对照,对市售的羊肉制品进行平行检测,评估本方法的检测性能。结果与磁珠手提法、柱提法相比,全自动核酸提取法的提取时间缩短了15~30 min,且提取的核酸扩增效果更好。全自动核酸提取法在羊猪混合样品中羊源核酸检出限为0.010mg/g。全自动核酸提取法在生鲜肉、生肉及熟肉制品等多种类型产品中提取的羊源核酸PCR检测结果的变异系数(coefficient of variation,CV)均小于3.000%。分别采用三重实时荧光定量PCR法与GB/T38164—2019对全自动提取的21份市售的涵盖不同类型的羊肉制品核酸进行平行检测,符合率为100.00%。结论本研究方法可为羊肉制品掺假的快速真伪鉴别提供操作简便、稳定灵敏、快速准确的整套解决方案。

不同提取方法及3种试剂盒对SARS-CoV2核酸检测效果评估

目的对3种SARS-CoV2核酸检测试剂盒、4种病毒核酸提取试剂盒以及2种自动核酸提取仪对新型冠状病毒核酸检测效果进行比较分析。方法采集新冠病毒弱阳性病人咽拭子标本,比较3种SARS-CoV2核酸检测试剂盒的灵敏度;以不同浓度新型冠状病毒阳性对照质粒为模板,使用4种核酸提取试剂盒、2种自动核酸仪对模板进行提取后进行RT-qPCR扩增实验,比较提取试剂盒及提取仪的提取效率。结果 A品牌SARS-CoV2核酸检测试剂盒灵敏度最高;磁珠法对病毒核酸提取效率高于离心柱法;核酸自动提取仪中品牌H(进口品牌)性能更佳。结论在新型冠状病毒的实验室诊断中,各种商业试剂盒质量参差不齐,实验室选择性能稳定、品质优越的核酸提取仪以及灵敏度、特异性、重复性最佳的核酸检测试剂盒对于实验室检测结果的可靠性更为重要,既可以为临床诊治提供参考,更能为传染病防控措施提供方向。

4种全自动核酸提取仪提取全血DNA效率的比较

目的比较4种全自动核酸提取仪在全血基因组检测中的核酸提取效果。方法分别用4个厂家的全自动核酸提取仪按预定的提取程序自动执行全血核酸提取,并与本实验室手工提取的核酸进行纯度和浓度比较。结果 4种全自动核酸提取仪提取全血核酸的260/280值均满足纯度1.7~2.0要求,并且核酸提取浓度高于本实验手工提取法或与本实验室手工提取法相当。结论 这4种全自动核酸提取仪提取效果优,自动化程度高,能满足临床标本应用。

长链醇类和油类物质洗涤液在磁珠法DNA和RNA共提取中的应用

目的探讨长链醇类和油类物质作为洗涤液在磁珠法核酸提取中的应用价值。方法分别以5种长链醇类物质(十一醇、正癸醇、正辛醇、1-壬醇、2-十二烷醇)和3种油类物质(二甲基硅油、FC-40、石蜡油)作为洗涤液,采用磁珠法对102~105拷贝/μL的DNA和RNA混合物进行共提取,以传统的70%乙醇洗涤液作为对照。采用聚合酶链反应(PCR)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对提取的核酸进行扩增,采用循环阈值(Ct)评价不同洗涤液的核酸提取效率。以油类物质为洗涤液,比较不同试剂状态(干式试剂、湿式试剂)、不同混匀方式(涡旋混匀、移液枪混匀、颠倒混匀)的核酸提取性能,并分析其用于提取临床样本病原体基因组核酸的性能。结果8种洗涤液中,二甲基硅油和FC-40的核酸提取性能与传统的70%乙醇基本一致,可有效提取出102~105拷贝/μL DNA或RNA,对PCR和RT-PCR均无抑制作用。以70%乙醇洗涤液为对照,将二甲基硅油或FC-40作为核酸提取洗涤液时,无论是配合干式试剂还是湿式试剂,无论采用哪种混匀方式,提取103拷贝/μL DNA和RNA模板的Ct值差异均无统计学意义(P>0.05);提取肺炎支原体模拟临床样本DNA的Ct值差异无统计学意义(P>0.05),且与商品化核酸提取试剂盒基本一致。结论二甲基硅油和FC-40可作为磁珠法核酸共提取的洗涤液,并可用于微流控产品的开发。

磁珠法核酸自动提取仪在分子生物学领域的应用

磁珠法核酸自动提取仪可以简单、快速、高效和经济地实现各种标本核酸的自动提取。本文概述了核酸自动提取仪的原理及分类,磁珠法核酸自动提取仪原理、分类、特点及其在分子生物学领域的应用。

磁珠法在提取核酸HIV-RNA检测中的应用研究

目的 观察评价分析磁珠法在提取核酸HIV-RNA检测中的应用效果。方法 选择2017年7月至2019年3月期间中山市第二人民医院爱心门诊经确诊艾滋病毒感染并接受抗病毒治疗的患者100例,运用磁珠法分离提取纯化核酸,荧光定量PCR检测系统及柱提取核酸荧光定量PCR检测系统测定病毒核酸HIV-RNA载量;随机对照试验分为两组,对患者的血清标本进行检测,对照组50例给予酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测HIV抗体,观察组50例给予磁珠法检测HIV抗体,并比较两组患者的检测准确率、敏感度及特异性。结果 观察组的检测准确率为96.00%,显著高于对照组的68.00%(χ^2=13.2791,P=0.0000);观察组检测敏感度与特异性分别为100.00%、100.00%,显著高于对照组的21.43%、18.18%(χ^2=36.2353、30.4615,均P<0.05)。结论 运用磁珠法分离提取纯化核酸,荧光定量PCR检测系统及柱提取核酸荧光定量PCR检测系统测定病毒核酸HIV-RNA载量,在艾滋病血清HIVRNA检测中,磁珠法的临床检测准确率、特异性、敏感度得到大幅度提高,在检测操作时方便、快捷、高效,值得临床检验科医师大力推广应用。