阿维链霉菌中aveD基因缺失对阿维菌素合成的影响

利用aveD基因的缺失载体pCZ8(pKC1 1 3 9∷△aveD)对阿维菌素 (Avermectin)产生菌阿维链霉菌 (Streptomycesavermitilis) 76 9的aveD基因进行缺失获得aveD缺失突变株。经摇瓶发酵和HPLC检测 ,发现该突变株只产生阿维菌素B组分。说明将阿维链霉菌的aveD基因缺失 ,并不影响下游aveF的表达。缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量基本相同 ,突变株中B1的产量略有提高 。

阿维链霉菌中aveD基因插入失活产生的异常组分(英文)

目的探索阿维链霉菌中aveD基因插入失活后对发酵产物组分的影响。方法采用将抗生素(安普霉素)抗性基因插入到aveD基因的方法,构建了重组质粒pID03;利用接合转移的方法将重组质粒导入到阿维链霉菌S-2(Streptomyces avermitilis S-2)菌株中,并通过抗性标记筛选双交换的菌株。结果得到了aveD基因插入失活的菌株AveD24。该菌株不再产生4个A组分,只产生4个B组分,同时还产生2个异常的组分,经HPLC和质谱分析,初步确定异常组分D24-1为寡霉素A,另一异常组分D24-2为5-酮avermectin la。

过量表达cyp71av1和cpr基因提高青蒿中青蒿素的含量

青蒿素是从青蒿植株地上部分提取的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯,是目前最有效的治疗疟疾的药物。为了提高青蒿中青蒿素的含量,根据GenBank中青蒿紫穗槐二烯氧化酶(CYP71AV1)和细胞色素P450还原酶(CPR)的基因序列设计特异引物,从青蒿cDNA中扩增出了cyp71av1和cpr基因片段,分别连上CaMV35S启动子和NOS终止子,然后将cyp71av1和cpr基因的表达盒依次插入到植物表达载体pCAM-BIA2300中,获得含有cyp71av1和cpr基因的植物表达载体p2300-GYR。通过农杆菌介导法转化青蒿,获得了20株转基因植株,PCR检测以及Southern杂交分析证实外源基因已被成功地导入青蒿基因组中。采用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素的含量,结果表明,大部分转基因青蒿中青蒿素的含量高于对照植株,其中,转基因青蒿中青蒿素含量最高约为对照的2.4倍。该研究证明过量表达cyp71av1和cpr基因是提高青蒿中青蒿素含量的有效方法。

CYP71AV1和CPR基因在转基因青蒿后代中的遗传分析

为研究CYP71AV1和CPR基因在转基因青蒿后代中的遗传及表达特性,在获得共转CYP71AV1和CPR基因青蒿(GYR)T0代的基础上,对其T2代用普通PCR和Southern Blot分别检测了目标基因分离比及部分植株中目标基因拷贝数;利用实时定量PCR分析了部分植株中目标基因的转录水平;利用HPLC-ELSD测定了其青蒿素含量;对其关键农艺性状也进行了测定。结果表明虽然目标基因在世代间可以顺利遗传,但其拷贝数则有一些不规则的变化,转基因位点的纯合较难实现;目标基因的表达也受到基因组的修饰限制系统影响。T2代青蒿素含量最高的一组平均含量比对照提高46.9%,植株鲜重和叶片干重则没有显著差异。本研究为进一步获得遗传稳定的转基因青蒿株系打下了基础。

只产阿维菌素B组分的基因工程菌的构建

目的通过对阿维菌素生物合成基因C5-O-甲基转移酶基因(aveD)内部进行缺失,使aveD基因失活,从而获得只产生阿维菌素B组分的基因工程菌。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pZHJ06,通过接合转移将缺失部分片段的aveD基因以双交换的方式整合到阿维链霉菌的染色体上。采用摇瓶进行发酵,采用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液中阿维菌素的组分。结果重组菌株不再产生阿维菌素A组分,只产生阿维菌素B组分,并且B组分的总产量也有所提高。结论将阿维链霉菌的aveD基因失活,并不影响下游酮基还原酶基因(aveF)基因的表达,重组菌株只产生阿维菌素B组分。