AEV-NH937引起禽脑脊髓炎的病理学观察

用禽脑脊髓炎病毒 NH93 7毒株脑内接种 1日龄 SPF雏鸡 ,分别在攻毒后 3 ,5,1 0 ,1 4 ,2 0 ,2 5和 3 0 d分别宰杀对照组两只和攻毒组 4只 ,取大脑和小脑、固定、HE染色。结果临床发病在第 6天出现 ,第 9天普遍发病并开始死亡 ,到第 1 4天死亡停止。在第 3天时 ,软脑膜充血出血、神经元出现少量变性坏死 ,第 1 0天和 1 4天损伤性变化最重 。

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

为获得禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis virus,AEV)VP1蛋白的单克隆抗体,通过原核表达AEV VP1蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得两株杂交瘤细胞株,命名为4#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示:制备的两株单克隆抗体亚型分别为IgG2b、IgG2a,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与AEV发生特异性反应而与其他家禽常见病毒均无交叉反应。采用建立的IFA方法对单抗进行了初步运用,在疫苗外源病毒检测AEV时,与经典方法的符合率100%。本研究成功制备了AEV单克隆抗体,为进一步建立AEV检测方法和深入研究AEV的生物学特性奠定了基础。

禽脑脊髓炎病毒Luminex xTAG检测方法的建立

为了建立一种灵敏快速检测禽脑脊髓炎病毒(AEV)的Luminex xTAG技术方法,本试验针对AEV高度保守的VP 1基因设计了1对特异性引物,在上游引物的5′端通过Spacer18间隔添加Tag序列,下游引物的5′端标记生物素,进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,构建质粒标准品,通过优化反应体系建立Luminex xTAG检测方法。用所建立的Luminex xTAG方法进行特异性、敏感性和重复性试验,并与SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法同时对45份脑组织临床样品进行检测。结果显示,所建立AEV Luminex xTAG检测方法与传染性法氏囊病毒、禽传染性贫血病病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒、禽白血病病毒、马立克病毒和禽传染性支气管炎病毒无交叉反应;灵敏度可达1×10^(2)copies/μL;批内和批间重复性试验的变异系数均小于4.0%;对45份临床样品的Luminex xTAG检测结果与SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。结果表明,所建立的AEV Luminex xTAG检测方法特异性好、灵敏度高、重复性和稳定性好,可用于AEV的快速检测。

我国禽脑脊髓炎病毒分离株全基因组的测定

测定了我国禽脑脊髓炎病毒(avianencephalomyelitisvirus,AEV)分离株L2Z株的全基因组核苷酸序列。该病毒株的3′和5′非编码区核苷酸序列用3′和5′RACE(cDNA末端快速扩增)法获得。基因组全长为7059个核苷酸残基,包括494个核苷酸残基的5′非编码区、6402个核苷酸残基的开放阅读框和136个核苷酸残基的3′非编码区及poly(A)尾巴。与已发表的AEV疫苗株1143的基因组序列比较发现,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为98%和97 6%。结构蛋白(VP1～VP4)中,主要宿主保护性免疫原蛋白VP1氨基酸之间差异较小。与小RNA病毒科其它病毒属相比,在非结构蛋白3D中,预测的8个RNA依赖性RNA聚合酶主要结构域中的4个高度保守。从而进一步确认了AEV的分子特性。

鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、传染性脑脊髓炎四联油佐剂灭活疫苗的研究

用NDV La Sota株、IBV M41株、EDS76 V HSH23株、AEV Van Roekel株为种毒,分别接种鸡胚或鸭胚,制备各种病毒抗原液,经福尔马林灭活后,采用FILTRON盒式超滤系统对制苗病毒抗原液进行浓缩,然后按一定比例混合,以司本80及吐温80为乳化剂,10号白油为佐剂,制成ND-IB-EDS76-AE四联灭活疫苗。对四联苗各项技术指标进行了测定,证明本疫苗安全、无任何副作用;免疫10-14 d后产生免疫力;ND部分效检,攻毒100％保护,每羽份含ND效价达50-123 PD50;IB部分效检,免疫21-28 d后攻毒保护率达80％-100％,IB HI效价≥1:64;EDS76效检,免疫后21 d HI效价≥1:128;AE效检,保护率达80％-100％。

禽脑脊髓炎病毒YL株的分离鉴定

为弄清陕西杨凌某鸡场种鸡产蛋量突然下降,种蛋孵化率降低,死雏、弱雏增多的原因,通过采集发病鸡脑组织进行SPF鸡胚连续传代、琼脂扩散试验（AGP）、人工感染试验、VP1基因的克隆及序列分析等对病原进行鉴定.结果显示,分离毒YL株与AEV标准阳性血清之间出现特异的沉淀线;在人工感染试验中可见雏鸡有震颤、共济失调等症状,剖检大脑有轻微的水肿和软化;成功克隆出AEV YL株的VP1基因,全长810 bp,编码270个氨基酸残基;与AEV参考毒株VP1基因核苷酸同源性92.0％～99.8％,氨基酸同源性为89.3％～99.3％;进化树分析表明,YL株与1143株、L2Z株和SX株亲缘关系较近,与VR株、HB株、SD株和NH937株亲缘关系较远.结果表明,分离毒株为禽脑脊髓炎病毒,与AEV已知毒株在进化方面存在一定程度的差异.

禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析

用冻存的禽脑脊髓炎病毒VanRoekel(AEVVR)株通过SPF鸡胚传代复壮 ,获得了试验用病毒株样本。根据已知禽脑脊髓炎病毒 114 3(AEV 114 3)株的衣壳蛋白VP0、VP3、VP1基因序列 ,设计了 3对引物 ,分别扩增AEVVR株的VP0、VP3、VP1基因 ,将RT PCR产物进行分子克隆和序列分析。结果表明 ,AEVVR株与AEV 114 3株VP0、VP3、VP1基因的核苷酸同源性分别为 95 .1%、93.6 %和 93.9% ;氨基酸的同源性分别为 97.5 %、97.5 %和 99.6 %。

禽脑脊髓炎病毒不同批次毒种致病性的研究

[目的]探讨不同批次的鸡源及胚源毒种致病性，为有效控制禽脑髓炎（AE）的发生提供参考。[方法]将AEV Van Roekel（VR）株毒种用雏鸡及鸡胚进行繁殖与传代，制备了不同批次的鸡源及胚源毒种，将这些毒种以不同接毒剂量经脑内接种8～10周龄的SPF鸡，进行致病性试验。[结果]不同批次的鸡源毒种致病性均很强，接种后可引起SPF鸡出现严重的禽脑脊髓炎症，不同批次的胚源毒种致病性存在明显差异，有强有弱。[结论]P080603和170807012个批次胚源毒种可以用作AE攻毒效检毒种。

禽脑脊髓炎病毒陕西分离株VP1基因的克隆及序列分析

对禽脑脊髓炎病毒(AEV)陕西分离株SX株VP1基因进行克隆和序列分析,了解VP1基因的分子生物学特征。根据发表的AEV VP1基因序列,设计并合成一对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出AEVSX分离株的VP1基因,将其克隆到pMD18-T载体上,进行序列测定后与已知的AEV毒株序列进行比较分析。结果表明,获得的AEV SX分离株VP1基因的全长为810bp,编码270个氨基酸残基;SX株与参考毒株VP1基因的核苷酸同源性为91.5%～99.4%,推导的氨基酸同源性为88.5%～98.9%;在1～7、19～25、149～155处有3个潜在抗原位点。系统进化树表明,SX株与1143、L2Z参考毒株的亲缘关系较近。

禽脑脊髓炎病毒感染鸡胚的病理学研究

６日龄ＳＰＦ鸡胚经卵黄囊分别接种禽脑脊髓炎病毒ＶａｎＲｏｅｋｅｌ株、１１４３株和ＮＨ９３７株，１０日后剖杀。鸡胚主要病变：眼观活动减弱，发育不良，体重减轻，皮下和脑部出血，脑积水和萎缩，脑重量明显减轻；光镜下见中枢神经组织非化脓性脑脊髓炎，腺胃、十二指肠、肝、胰、肾淋巴细胞浸润，骨骼肌萎缩、肌间水肿，其中神经细胞中央染色质溶解具有证病意义；电镜下脑神经细胞胞核淡染，胞浆内近核处粗面内质网崩解，十二指肠上皮细胞、胰岛细胞胞浆内含有约２５～３０ｎｍ密集或散在的病毒颗粒。

禽脑脊髓炎病毒在BGM-70传代细胞系上培养特性的初步研究

进行了 禽脑脊 髓炎病 毒 Ｌ２ Ｚ 株在 Ｂ Ｇ Ｍ７０ 传 代 细胞 系上 培 养特 性的 研 究。该 毒 株 在细胞上盲 传３ 代后 能产生明 显的细 胞病变，并 且传代 过程中 细胞 病变 稳定 地出 现。利 用琼 脂扩 散试验、免疫 荧光试 验、免疫酶 试验及 负染电镜 观察 研究 表 明， Ｌ２ Ｚ 株 接种 Ｂ Ｇ Ｍ７０ 细 胞具 有良 好 的增殖特性 ，并且病 毒是在细 胞浆中 进行复制 。该研究 报道禽 脑脊髓 炎病 毒能 成功 地在 传代 细胞 系上培养增 殖。

禽脑脊髓炎病毒的分离与初步鉴定

禽脑脊髓炎(ＡＥ)是一种主要侵害雏鸡的病毒性传染病,以共济失调、头颈快速震颤、衰竭死亡为特征。本病1930年最早发现于美国〔1〕,此后,世界所有养禽地区均有发生,我国许多省、市、区均有发生本病的报道〔2〕,山东省对本病的报道多见〔3,4〕,但大都缺乏对ＡＥ病毒分离与?..

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)Van Roekel株作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选,间接免疫荧光法(IFA)和免疫组织化学法鉴定,经3次亚克隆得到了稳定分泌抗AEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株F11和G2,制备了腹水,并利用该单克隆抗体初步建立了Dot-ELISA、间接ELISA和IFA等特异性检测AEV抗原的方法。

禽脑脊髓炎病毒(VR株)接种鸡胚的病理变化

通过卵黄囊接种法,将禽脑脊髓炎病毒接种到8日龄SPF鸡胚内,继续在孵化箱内孵化。第17天收病毒,经观察,接毒的鸡胚局部有出血点、体重减轻、爪子弯曲等病理变化。

禽脑脊髓炎病毒VP1、VP3、VP0基因表达载体的构建

根据AEV-NH937基因组全序列设计3对引物,应用RT-PCR方法,扩增出AEV的外壳蛋白VP1、VP3、VP0基因,将它们克隆于pUCm-T载体上进行序列分析。结果显示,AEV-NH937病毒株VP1基因全长810 bp、编码270个氨基酸,VP3基因全长735 bp、编码245个氨基酸,VP0基因全长726 bp、编码242个氨基酸;与Calnek疫苗株相比,AEV-NH937病毒株VP1、VP3、VP0基因的核苷酸同源性分别为90.62%、93.88%、95.45%,氨基酸同源性分别为88.89%、97.96%、98.35%。将VP1、VP3、VP0基因分别插入载体pcDNA4/His Max构建表达重组质粒并转入宿主菌DH5α中,使基因得以表达。

禽脑脊髓炎病毒VP1基因植物表达载体的构建

以提取的禽脑脊髓炎病毒总RNA为模板,以P1和P2为引物,反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。将扩增产物克隆pMD18-T载体中,获得重组质粒pMD18-T-VP1,PstⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR确认正确后,利用pMD18-T-VP1重组质粒为模板,以P3和P4为引物,经PCR扩增获得了大小约810bp的产物。VP1基因和pBI121植物表达载体用SmaⅠ和SacⅠ双酶切,经纯化后连接,再转化到EHA105农杆菌中,酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒pBI121-VP1,为进一步利用转基因植物生产VP1蛋白奠定了基础。

SPF雏鸡感染禽脑脊髓炎病毒内蒙株早期IgM与IgG变化规律的研究

本研究采用了病毒接种技术、普通病理学方法、酶联免疫吸附试验等方法,研究了不同日龄SPF雏鸡人工感染AEV-NH937株后的血清IgM、IgG的动态变化规律。实验结果显示IgM在攻毒后第3天达到峰值(0.57mg/m l),说明已有一部分B淋巴细胞分化为浆细胞并产生IgM;IgG从第10天开始呈上升趋势,在第20天达到峰值(5.05mg/m l);感染鸡外周血清中先出现IgM,后出现IgG,说明IgM为初级反应最早出现的免疫球蛋白,在感染早期起着先锋免疫作用。当IgG出现后,IgM的合成即受到抑制。抗AEV的血清IgM和IgG在时间上和强度上出现双峰现象。

禽脑脊髓炎病毒基因组的BLASTN/P分析

目的:从基因组水平出发,为禽脑脊髓炎病毒(AEV)的属种划分提供依据。方法:利用生物信息学方法,对AEV基因组序列和多聚蛋白质序列进行BLASTN/P搜索,找出与AEV基因组和多聚蛋白序列具有最大同源性的序列。结果:AEV与HAV的基因组序列和蛋白序列的同源性最大。结论:AEV与HAV的亲源关系最近,建议将AEV归类为小RNA病毒科甲肝病毒属。

应用差速离心法提纯禽脑脊髓炎病毒及电镜观察

为了建立一种有效的方法分离禽脑脊髓炎病毒(A v ian Encepha lom ye litisV irus,AEV),本实验通过SPF鸡胚首先来增殖AEV.将1:5倍稀释的AEV-NH 937株和阴性对照磷酸缓冲盐溶液分别经卵黄囊接种于6日龄SPF鸡胚,继续孵化10d后,收集尿囊液.比较接种组和健康对照组鸡胚的大小,结果显示,健康对照组鸡胚明显大于接种组.取接种组的胚脑、消化道和胰腺,经匀浆后与同组尿囊液配成1:5的组织悬液.应用差速离心法从该组织悬液中分离纯化AEV,经纯化的AEV被磷钨酸染色后,电镜下可观察到大量AEV粒子.结果表明,差速离心法提纯禽脑脊髓炎病毒效果良好.

禽脑脊髓炎病毒VP3基因的克隆与序列测定

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒 (AEV)序列设计了 1对引物 ,利用RT PCR技术 ,从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑以及内脏器官组织中成功扩增出了VP3基因 ,回收、纯化后克隆到T载体中 ,用常规方法转化JM1 0 9感受态细胞。阳性重组质粒经酶切及PCR鉴定后测定核酸序列。结果表明 ,VR株VP3基因全长 73 5bp ,共编码 2 4 5个氨基酸 ,与AEV 1 1 4 3标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为 93 .0 %和 97.0 % ;