禽类基因工程重组干扰素研究进展

近年来 ,多种禽类干扰素基因已被克隆和在大肠杆菌中表达。禽类基因工程重组干扰素在抗马立克病毒、劳斯肉瘤病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒方面效果显著 ,展现出了广阔的应用前景。

重组鸡γ-干扰素对H5亚型禽流感灭活苗的免疫增强作用

为研究重组鸡γ-干扰素(Chicken interferonγ,ChIFN-γ)对禽流感灭活疫苗的免疫增强效果,使用重组鸡γ-干扰素作为免疫佐剂,联合禽流感灭活疫苗采用胸部肌肉注射的方式免疫SPF雏鸡,免疫后每周测定血清抗体效价、免疫器官T、B淋巴细胞转化水平,攻毒后计算攻毒保护率。结果表明,鸡γ-干扰素提高了血清抗体水平,免疫器官T、B淋巴细胞转化水平和攻毒保护率,与疫苗组相比多数指标差异显著(P<0.05)。鸡γ-干扰素对H5亚型禽流感灭活疫苗具有免疫增强作用。

不同H5N1亚型高致病性禽流感病毒诱导IFN-α/β和MxA mRNA表达

目的:用两株鹅源H5N1禽流感病毒(AIV)接种A549细胞,比较两毒株在细胞中的增殖情况,以及病毒诱导细胞干扰素(INF)-α/β和黏病毒抗性蛋白A(MxA)mRNA表达的情况。方法:将两组病毒悬液接种A549细胞,按Reed-Muench法计算两毒株的组织培养半数感染量(TCID50),PCR扩增检测细胞中病毒的HA和M1片段。Real-time PCR方法检测细胞中IFN-α/β和MxA mRNA表达。结果:两株病毒均能感染A549细胞,AIV128诱导细胞的IFN-α/β和MxA mRNA表达均较AIV75高。结论:H5N1亚型AIV75和AIV128毒株能在人肺泡癌上皮细胞A549中复制,细胞IFN-α/β和MxA mRNA的表达诱导依赖于病毒的复制。

禽呼肠病毒主要蛋白的研究进展

禽呼肠病毒能引起鸡的腱鞘炎、吸收 障碍综合征和呼吸道疾病。目前已得到鉴定 的该病毒蛋白有15个,每个蛋白的结构和功 能各不相同。以三聚体形式存在的σ3蛋白 是与致病性有关的细胞结合蛋白;P10蛋白 是能提高病毒侵入细胞能力的跨膜融合蛋 白;σ1具有核苷酸焦磷酸酶和结合宿主双链 RNA的功能,因而能水解NTP及抑制干扰 素的合成;σNS与μNS一起形成一个引导 mRNA和病毒颗粒到病毒合成场所及细胞间 质的框架;具有转录酶活性的μ2蛋白能提高 ARV对细胞的攻击能力;λ3蛋白具有鸟苷酸 转移酶的活性。

干扰素对鸡胚内H9N2亚型禽流感病毒滴度的影响

为探讨干扰素在动物上的运用,笔者利用H9N2亚型禽流感病毒与不同剂量干扰素(IFN)一起接种鸡胚,运用HA方法测定病毒效价,研究了干扰素干扰H9N2亚型禽流感病毒在鸡胚内增殖的情况,试验结果表明,高中低剂量干扰素都有抑制病毒增殖的作用,而3个试验组之间没有明显差异(P>0.05)。但是在一定的时间内,高剂量组干扰素与中低剂量组相比能够明显的抑制病毒增殖,表明高剂量组干扰素在一定时间内抑制H9N2禽流感病毒的作用比较明显,这在生产中有一定的应用价值。

共表达H_9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效的抗低致病性H9亚型禽流行性感冒 (流感 )的基因工程疫苗 ,将包含有H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素 (HA)基因、鸡Ⅱ型干扰素 (IFN Ⅱ )全长cDNA序列及调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子 (PE/L)的基因片段 ,定向插入鸡痘病毒转移载体 1175的痘苗病毒启动子P7.5的下游 ,得到HA和IFN Ⅱ基因分别处于P7.5及PE/L转录调控下的重组转移载体 1175HAIFN。以脂质体转染法将 1175HAIFN转染至已感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株 (wt FPV)的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中。 1175HAIFN与wt FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV HA IFN Ⅱ。通过在含X gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rF PV HA IFN Ⅱ。以间接免疫荧光法和细胞病变抑制试验证实 ,纯化的rFPV HA IFN Ⅱ感染的CEF能以非融合的方式同时表达HA和具有抗VSV活性的鸡IFN Ⅱ。动物试验表明 ,rFPV HA IFN Ⅱ能显著抑制静脉攻毒后 1日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒 ,且能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒 (rFPV HA)抑制 1日龄SPF雏鸡增重的副作用。

中药加味麻杏石甘汤对传染性支气管炎病毒感染雏鸡的保护作用及其机制分析

为研究中药组方加味麻杏石甘汤对人工感染传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)雏鸡的保护作用及其作用机制,将240只15日龄雏鸡随机分为6组:健康对照组、IBV接种组、利巴韦林治疗组及加味麻杏石甘汤高、中、低剂量治疗组。IBV接种组及各治疗组雏鸡的接种病毒量为3×10-5.68EID50/0.3 mL,于攻毒后48 h进行治疗,剂量分别为0.01%利巴韦林和0.6%、0.4%、0.2%加味麻杏石甘汤。ELISA方法检测各组雏鸡血清中细胞因子γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)与白介素4(interleukin 4,IL-4)含量。结果显示:IBV接种组雏鸡血清中IL-4水平显著升高,IFN-γ水平显著降低;经过药物干预治疗以后,血清中IL-4水平降低,IFN-γ水平提高。各药物治疗组之间,中药高、中剂量组IFN-γ水平高于低剂量组和利巴韦林组,IL-4水平较之偏低。可见,加味麻杏石甘汤可使IBV感染雏鸡血清中IFN-γ含量上调,IL-4含量下调,其保护机制可能是通过改善IBV感染导致的Th1/Th2失衡而起作用。

禽呼肠孤病毒感染DF1细胞后干扰素刺激基因在转录水平表达量的动态变化

为了解干扰素(interferon,IFN)和干扰素刺激基因在禽呼肠孤病毒(ARV)感染DF1细胞后的表达情况,试验将ARV病毒感染DF1细胞,观察细胞病变,收集感染后0、6、12、24、36、48、72、96 h的细胞样品,抽提反转录成cDNA,通过实时荧光定量PCR技术检测干扰素IFN-α和IFN-β及9种禽源常见干扰素刺激基因在感染后不同时间点在转录水平表达量的动态变化规律。结果显示,在ARV感染DF1细胞后,DF1细胞出现典型的细胞病变,感染后12 h病毒开始快速增殖,在36~96 h维持在较高的水平;IFN-α和IFN-β在转录水平的表达量在感染后均表现为显著下调(P<0.05;P<0.01);IFI6、OAS、IFIT5、ISG12在转录水平表达量变化规律相似,均呈现显著上调表达(P<0.05;P<0.01),在感染后96 h达到峰值;其中IFIT5的上调幅度最大,感染后96 h的表达量是0 h的19.62倍(P<0.01);而Mx、IFITM3、PKR、Viperin、ZAP的表达量变化规律相似,均表现为显著下调表达(P<0.05;P<0.01),其中Mx、IFITM3、Viperin的下调幅度较大,PKR和ZAP下调幅度很小。说明在ARV感染DF1细胞后,干扰素及多种干扰素刺激基因在转录水平呈现规律性变化,与病毒在DF1细胞中复制存在一定的联系。结果表明,ARV感染后可以诱导多种干扰素刺激基因的表达,这些干扰素刺激基因在抵御ARV病毒的入侵,抑制ARV的复制、释放及病毒的清除中发挥着重要作用。本研究为今后深入研究ARV的致病机理和宿主的抗病毒免疫应答提供了参考。

禽类干扰素受体介导的抗病毒免疫机制研究进展

干扰素受体作为一种"分子开关",参与调控宿主抗病毒免疫状态和细胞免疫因子的表达水平。作为抗病毒信号传导中的重要枢纽,干扰素受体表达水平的高低直接影响着机体抗病毒免疫反应状态。干扰素受体通过介导宿主抵抗外来病原体的信号级联放大效应来增强机体的抗病毒免疫状态。该正反馈调控机制是抗病毒感染中最重要的免疫扩大反应,也是宿主抵御病毒入侵和增殖的核心反应。禽类干扰素受体研究尚处于起步阶段,本文就干扰素受体的结构和分类,抗病毒效应蛋白质,以及禽类干扰素受体介导的抗病毒免疫机制的最新研究进展作一综述。

武定鸡IFN-γ基因-316A/GSNP对H5N1亚型高致病性禽流感灭活疫苗免疫效果的影响

为探讨γ干扰素(IFN-γ)基因-316A/G SNP对云南地方鸡品种武定鸡接种H5N1亚型高致病性禽流感(HPAI)灭活疫苗效果的影响,随机选取100只同日龄母源抗体阴性的武定鸡,应用PCR结合DNA测序确定其IFN-γ基因-316A/G SNP分布状况,同时应用血凝抑制试验(HI)测定免疫前和再次免疫后血浆特异抗体水平,随后采用卡方检验总样本基因型频率是否处于Hardy-Weinberg平衡,并采用最小二乘分析检查基因型组间抗体水平差异。结果发现,该试验样本符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),并且存在随着A取代G抗体水平呈逐渐升高的趋势,即与GG基因型(n=20,7.90±0.343)相比,AG基因型(n=56,8.62±0.205)的抗体水平升高不显著(P>0.05),但AA基因型(n=24,9.04±0.313)的抗体水平升高显著(P=0.0157<0.05)。结果表明,IFN-γ基因-316A/G SNP与武定鸡HPAI特异性抗体应答水平存在关联性,这对培育AA基因型抗病品系和制定合理的HPAI免疫程序具有积极的指导意义。

猪细小病毒结构蛋白VP_1和VP_2的基因免疫研究

利用真核表达载体pCIneo和pcDNA3 1( +)分别构建了含有猪细小病毒VP1基因的 pCIneoVP1和含有VP2基因的 pCIneoVP2 与 pcDNAVP2 三种真核表达质粒。将上述三种真核表达质粒分别转染IBRS 2细胞 ,利用间接ELISA检测表达情况 ,结果表明上述三种质粒均能在IBRS 2细胞表达 ,表达产物位于细胞中。在此基础上 ,利用这三种质粒分别以肌内注射的方式 ,间隔 2周 2次免疫小鼠 ,结果发现所有表达质粒均能诱导产生明显的细胞免疫和体液免疫 ,其中pCIneoVP1质粒诱导的体液免疫最强 ,与猪细小病毒灭活疫苗免疫组相当 ,pCIneoVP2 诱导的细胞免疫应答强于PPV灭活组 ,pCIneoVP1和 pCIneoVP2 联合免疫并没有加强作用。

禽干扰素在免疫应答中的研究进展

干扰素是一种诱生性糖蛋白,有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节等多种生物学作用。当畜禽感染病毒时,干扰素是最先发挥作用的抵抗分子。干扰素参与早期黏膜免疫并通过产生一系列与免疫调节相关的细胞因子来活化机体的天然免疫与适应性免疫应答从而使机体处于抗病毒状态。干扰素因其重要的生物学功能,在流行性病毒病防治的应用中越来越广泛。本文从不同种类的禽干扰素与免疫系统相互作用的角度出发,阐述禽干扰素的分类、产生、功能及应用,重点阐述了不同种类禽干扰素的特点,旨在为禽干扰素作为禽类疫苗免疫增强剂的研制提供参考。

重组鸡α干扰素抑制H9N2禽流感病毒在鸡胚中增殖的研究

为检测重组鸡α干扰素（rChIFN-α）抑制H9N2禽流感病毒（AIV）在鸡胚中的增殖效力,本研究将rChIFN-α按其抗病毒效价高低分为4个组（10-7 U/mL、10-6 U/mL、10-5 U/mL和10^4 U/mL）,同时设置阴性对照组和病毒对照组。各实验组再依次按照给药时间不同又分为“先给药再接种病毒组”、“同时给药和接种病毒组”及“先接种病毒再给药组”3个小组进行试验,通过检测H9N2 AIV血凝效价的变化、H9N2 AIV HA基因拷贝数以及各组EID50评价rChIFN-α对H9N2 AIV增殖抑制效力。结果显示,除低剂量组以外,各剂量组与病毒对照组相比,结果均可以显著降低鸡胚尿囊液中H9N2 AIV的血凝效价（p〈0.01）,同时能够显著减少H9N2 AIV基因的拷贝数（p〈0.01）及显著降低EID50（p〈0.01）。表明中等剂量（10-5 U/mL）及更高剂量的rChIFN-α在鸡胚中能够显著抑制H9N2 AIV的增殖。本研究为rChIFN-α今后在临床中抗AIV治疗的实际应用提供了相关实验依据。

禽干扰素抗病毒机制及在家禽生产中的应用

干扰素(IFN)是一类由活化的T细胞和自然杀伤细胞产生的具有广谱抗病毒活性和免疫调节功能的糖蛋白。当病毒入侵机体时,干扰素最先发挥作用。干扰素在抵抗病毒感染和干扰病毒复制等方面起重要作用,被广泛应用于家禽流行性病毒等疾病的预防和治疗中。文章就几种不同类型禽干扰素的抗病毒机制进行综述,包括禽干扰素的产生及分类、作用机制、应用等,为其在家禽生产中的应用提供参考。

稳定表达人IFITM3的A549细胞株建立及其对禽流感病毒感染的抑制作用

目的:为深入研究IFITM3抗禽流感病毒作用及其分子机制提供细胞模型,建立稳定表达人IFITM3蛋白的A549细胞株。方法:首先合成引物,分离人外周血单个核细胞,PCR扩增IFITM3基因,进行DNA测序分析。测序正确后,将其克隆至慢病毒表达载体p LV-Puro中构建真核表达质粒p LV-IFITM3,转染A549细胞,在确定IFITM3可表达后,利用嘌呤霉素加压筛选稳定表达IFITM3的细胞株,通过荧光定量PCR和Western blot方法对获得的稳定细胞株进行鉴定,同时分析IFITM3蛋白在稳定细胞株的分布及其对细胞活性的影响。最后,基于建立的稳定细胞株,用H5N1亚型禽流感病毒作为病毒测试模型,对IFITM3的抗病毒活性进行了初步评价。结果:成功获得人外周血单个核细胞源IFITM3基因,构建了重组慢病毒表达质粒,并通过质粒转染结合嘌呤霉素压力筛选获得稳定表达IFITM3的A549细胞,且IFITM3主要分布在膜组分上,并对细胞活性无显著影响,同时IFITM3可抑制H5N1亚型禽流感病毒感染。结论:成功获得稳定表达IFITM3的A549细胞,证明了IFITM3可抑制H5N1亚型禽流感病毒感染,为进一步深入探讨IFITM3限制流感病毒感染的作用机制和分子机理提供了细胞模型和实验基础。

H5N1感染A549细胞诱导天然免疫的作用机制

研究高致病性禽流感病毒H5N1亚型感染人肺癌细胞后诱导天然免疫的作用机制,用鸡胚来源的禽流感病毒50 HAU感染人肺癌细胞,通过荧光定量PCR、细胞转染以及荧光素酶报告基因等实验方法检测细胞内过表达和低表达RIG-I后干扰素-β的表达情况;用不同亚型的禽流感病毒感染细胞后,检测NS1蛋白的表达情况.结果表明,在细胞内过表达RIG-I能够提高禽流感病毒对IFN-β基因启动子的刺激.相反,细胞内过表达RIG-I的阴性区域(RIG-I-K270A)则抑制了禽流感病毒诱导的IFN-β反应.来源于高致病性禽流感H5N1的NS1蛋白更明显拮抗了干扰素的效果.说明高致病性禽流感H5N1通过RIG-I的识别诱导干扰素的产生;NS1蛋白是拮抗干扰素发挥效应的关键蛋白.

H5N1亚型禽流感病毒和新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞IFN-β基因的动态表达

根据鸡β-干扰素（ChIFN-β）基因保守序列设计引物建立了检测鸡IFN-βmRNA表达水平的荧光定量RT-PCR（RRT-PCR）方法,并对H5N1亚型禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒强毒株（vNDV）感染后3、6、12、24、30 h的鸡胚成纤维细胞（CEF）中IFN-βmRNA表达水平进行了检测。结果显示,建立的RRT-PCR特异性好,对鸡IFN-βmRNA的扩增效率为94.18%,线性范围为10-8-10-3,相关系数为0.992,最低能检出48拷贝/反应。AIV在感染CEF后6、12 h显著抑制IFN-βmRNA的表达,24 h开始诱导IFN-βmRNA表达,30 h时IFN-βmRNA水平显著升高;vNDV在感染CEF后的24 h内显著抑制IFN-βmRNA的表达,30 h时则显著诱导IFN-βmRNA表达。本试验结果为进一步研究H5N1和NDV与机体的相互作用提供了有价值的信息。

干扰素诱导跨膜蛋白3在H7N9中的研究进展

截至2014年5月16日，高致病性禽流感病毒H7N9已引起国内122人死亡。干扰素诱导跨膜蛋白3是干扰素诱导的跨膜蛋白家族的一分子，具有广泛的抗病毒作用，在甲型流感病毒感染中可以早期抑制病毒的复制从而发挥作用。本文对干扰素诱导跨膜蛋白3在禽流感病毒H7N9中的研究进展进行了简要阐述。