免疫斑点法检测NADH-细胞色素b5还原酶活性

在硝酸纤维素膜上点有抗细胞色素ｂ５还原酶（ｂ５Ｒ）单克隆抗体，以捕捉红细胞裂解液中的ｂ５还原酶，然后用还原型辅酶Ⅰ－二氯酚靛酚－噻唑蓝底物缓冲液进行活性染色。遗传性高铁血红蛋白血症５个不同家系患者（５例）ｂ５还原酶活性检测结果均为阴性，正常对照为强阳性。本法是一种简便。

NADH-细胞色素b5还原酶突变型蛋白的结构与功能研究

目的探讨NADH-细胞色素b5还原酶基因突变引起遗传性高铁血红蛋白血症的分子病理机制,研究突变型(b5R)蛋白结构和功能的关系。方法用基因重组技术将野生型和突变型(L72P)b5RcDNA克隆于pGEX-2T载体,在大肠杆茵BL21中诱导表达。Western印迹鉴定表达的蛋白为GST-b5R融合蛋白。应用谷胱甘肽-Sepharose4B亲和层析,还原型谷胱甘肽洗脱得到纯化的GST-b5R和GST-b5RL72P融合蛋白,比较GST-b5R和GST-b5RL72P酶活性。结果突变型酶活性低,为野生型的3%。结论L72P突变可引起蛋白质二级结构改变从而导致酶的活性下降。

siRNA表达载体介导靶向NADH-细胞色素b5还原酶基因的RNA干扰实验研究

目的探索经载体介导的RNA干扰抑制人NADH-细胞色素b5还原酶(b5R)基因表达的可行性。方法应用网络在线软件设计并合成两条针对b5R mRNA的RNA干扰的DNA模板片段,分别将其克隆至经过改建、带有neo基因的pSilencer1.0-U6载体上,构建成siRNA真核表达载体;脂质体转染法将上述重组质粒转入人肺成纤维细胞和BEL-7402肝癌细胞株。通过半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR分析,检测所构建的重组siRNA真核表达载体对b5R基因表达的干扰效应。结果获得两个能在细胞内生成靶向b5R基因siRNA的重组载体pSib5R-1和pSib5R-2;其中pSib5R-2对成纤维细胞b5RmRNA的抑制率达81·7%,对BEL-7402细胞b5RmRNA的抑制率达60%。结论两种细胞b5R基因的表达均可被载体介导的RNA干扰有效抑制;成功构建了针对b5R基因的siRNA表达载体,为建立稳定表达siRNA的、b5R酶缺陷的细胞模型提供了实验基础。

NADH-细胞色素b5还原酶电泳测定法

目的：为了在我国建立一种新的b5R酶活性测定方法。方法：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）结合b5R酶活性杂色对正常人及五个RCMⅠ型家族的先证者和杂合子红细胞的b5R酶活性进行测定。结果：正常人及杂合子血红蛋白带后均出现一蓝色区带，正常人的蓝色带比条合子深，而五个先证者未见此蓝色条带。结论：此法简单、快速，可作为遗传性高铁血红蛋白血症（RCM）的筛选实验。

丙基硫氧嘧啶对甲状腺NADH-细胞色素b_5还原酶活性影响

目的 探讨丙基硫氧嘧啶 (PTU)抗甲状腺作用新的药理机制。方法 以高铁氰化钾和二氯酚靛酚为底物测定NADH 细胞色素b5还原酶 (b5R)活性 ,应用高香草酸荧光分析技术对H2 O2 浓度进行测定 ,观察PTU对甲状腺b5R活性和H2 O2 浓度影响。结果 PTU可抑制b5R活性 ,且呈浓度依赖性 ,0 0 5mmol·L-1PTU即对b5R活性有抑制作用 ,以后随PTU浓度增加 ,b5R活性逐渐降低 ;H2 O2 浓度则随b5R活性降低而下降。NADH有拮抗PTU对b5R的抑制作用。结论 PTU对甲状腺b5R活性有抑制作用 ,抑制b5R活性从而抑制H2 O2

NADH-细胞色素b_5还原酶与散发性甲状腺肿的关系

目的 探讨 NADH-细胞色素 b5 还原酶 (b5 R)在散发性甲状腺肿发病中作用。方法 应用荧光分析等技术测定甲状腺 b5 R活性和 H2 O2 浓度 ,用 b5 R抑制剂观察 b5 R活性变化对 H2 O2 浓度和蛋白结合碘 (PBI)形成影响。结果 甲状腺 H2 O2 浓度和 PBI形成随 b5 R活性降低而减少 ,抑制 b5 R活性可抑制 H2 O2 和 PBI的形成。H2 O2 酶可明显减少 PBI形成 ,而葡萄糖和葡萄糖氧化酶系统可增加 PBI形成。结论 b5 R参与甲状腺 H2 O2 生成 ,b5 R活性缺乏在散发性甲状腺肿发病中可能起重要作用。

细胞色素b5还原酶杂合其他类型红细胞遗传缺陷致溶血性疾病二例

例1男，23岁，紫绀20余年，逐年加重，活动后心悸、胸闷，伴气促、紫绀。肺功能正常。心率58次／mjn，无杂音。心脏彩超：左室、右房扩大。外院行剖胸探查术未见异常，术中见动静脉血均呈褐色。巩膜无黄染，腹部B超肝脾胆胰正常。总胆红素19μmol／L，结合胆红素8．1μmol／L。肝功酶、肾功等生化指标和病毒学指标均正常。本院检查：（1）血象：白细胞（WBC）7．45×10^9／L，红细胞（RBC）5．5×10^12／L，血红蛋白（Hb）173g/L，网织红细胞（Ret）1．2％，RBC平均体积（MCV）92．2fl，平均红细胞血红蛋白含量（MCH）31．5Pg，平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）341g／L，血小板（PLT）197×10^9／L。

膜上斑点洁显示人红细胞b_5还原酶活性

人红细胞ＮＡＤＨ－细胞色素ｂ５还原酶是使高铁血红蛋白还原的主要酶类，其缺陷将导致遗传性高铁血红蛋白血症．目前，主要通过分光光度法测定ｂ５还原酶活性．我们将ｂ５还原酶抗体点于硝酸纤维膜上，以此捕获并富集红细胞胞浆ｂ５还原酶．有ｂ５还原酶活性的斑点用噻唑蓝染色．此法简单直观，可用于ｂ５还原酶的定性和半定量测定，为遗传性高铁血红蛋白血症的诊断提供了一种新的实验手段．

NADH-细胞色素b_5还原酶在甲状腺过氧化氢生物合成中的作用

应用高香草酸荧光分析技术及NADH-高铁氰化钾还原酶法,对正常和Graves病甲状腺过氧化氢（H2O2）和NADH-细胞色素b5还原酶（b5R）进行测定,发现Graves病甲状腺b5R活性和H2O2水平均明显高于正常,而H2O2酶活性在Graves病和正常甲状腺间无显著差异。加b5R抑制剂对氯汞苯甲酸抑制b5R活性,Graves病和正常甲状腺b5R活性降低近85％,同时H2O2降低近50％,蛋白结合碘形成减少近52％。b5R活性和H2O2水平两者呈显著正相关关系。以上结果表明,b5R参与甲状腺内H2O2的生物合成,是甲状腺内产生H2O2的重要酶系。

Graves病甲状腺NADH-细胞色素b_5还原酶活性与碘有机化关系

目的 :探明 NADH-细胞色素 b5 还原酶 (b5 R)在甲状腺激素合成中的作用。方法 :应用 NADH-高铁氰化钾等测定甲状腺 b5 R和 H2 O2 酶活性 ,并在体外建立碘有机化系统 ,观察 b5 R活性与有机碘形成关系。结果 :Graves病 (GD)b5 R活性明显增高 ,所形成的有机碘也明显增多 ,应用 b5 R抑制剂后有机碘形成又明显减少。GD时 H2 O2 酶活性无改变。结论 :b5 R在甲状腺激素合成中起重要作用 ,抑制 b5 R活性就能抑制甲状腺激素合成。

RNA干扰法建立人NADH-细胞色素b5还原酶缺陷的细胞表型

目的探索经载体介导的RNA干扰法建立人NADH-细胞色素b5还原酶（EC1．6．2．2，NADH-cytochrome b5 reductase，65R）缺陷细胞系的可行性。方法设计并构建b5R的两种小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）表达载体，脂质体转染法瞬时转染BEL-7402细胞，半定量逆转录-PCR分析重组载体的干扰效应；G418筛选两种表达载体稳定转染的BEL-7402细胞，并通过稳定转染的细胞克隆在b5R mRNA水平，酶活性，酶含量等方面干扰效果的鉴定，获得b5R缺陷的细胞克隆；噻唑蓝法测定b5R缺陷细胞的生长曲线。结果获得两个靶向b5R基因的siRNA重组表达载体pSib5R-1和pSib5R-2，其中pSig5R-2瞬时转染对BEL-7402细胞b5RmRNA的抑制率达68．3％。获得18个稳定转染的细胞克隆，pSib5R-2转染的克隆中有两个克隆b5RmRNA抑制率达48．2％和56．2％，酶活性抑制率为54．6％和63．5％，酶含量也有明显降低。b5R酶缺陷没有改变细胞的生长速度。结论b5R基因的表达可被载体介导的RNA干扰有效抑制，成功建立了b5R缺陷的细胞表型，为进一步研究b5R基因的功能以及探讨Ⅱ型隐性先天性高缺血红蛋白症的发生机制提供了实验依据和材料。

NADH-细胞色素b_5还原酶在甲状腺过氧化氢生物合成中的作用

目的 探讨 NADH-细胞色素 b5还原酶 (b5R)在甲状腺过氧化氢生物合成中作用。 方法 应用高香草酸荧光分析技术及 NADH-高铁氰化钾还原酶法 ,对正常和格雷夫斯病甲状腺过氧化氢 (H2 O2 )和 b5R进行测定 ,同时观察 b5R抑制剂对 H2 O2 生成和蛋白结合碘形成的影响。 结果 格雷夫斯病甲状腺 b5R活性和 H2 O2 水平均明显高于正常 ,而 H2 O2 酶活性在两者间差异无显著性。加 b5R抑制剂对氯汞苯甲酸抑制 b5R活性 ,格雷夫斯病和正常甲状腺 b5R活性降低近 85 % ,同时 H2 O2 降低近 5 0 % ,蛋白结合碘形成减少近 5 2 %。 b5R活性和 H2 O2 水平两者呈显著正相关。 结论 b5R参与甲状腺内 H2 O2 的生物合成 ,是甲状腺内产生 H2 O2 的重要酶系。

Graves病甲状腺NADH－细胞色素b_5还原酶活性变化

以ＮＡＤＨ－高铁氰化钾还原酶法对Ｇｒａｖｅｓ病和正常甲状腺ＮＡＤＨ－细胞色素ｂ_５还原酶（ｂ_５Ｒ）及过氧化氢酶活性进行测定。发现Ｇｒａｖｅｓ病时甲状腺的ｂ_５Ｒ活性明显增高，而过氧化氢酶活性无改变；Ｇｒａｖｅｓ病患者甲状腺ｂ_５Ｒ活性与其治前血中甲状腺激素水平呈显著正相关。表明Ｇｒａｖｅｓ病时甲状腺内产生过氧化氢酶系活性增高，可能是其甲状腺激素合成增多的重要环节。

NADH-细胞色素b5还原酶突变型的原核表达及产物纯化

遗传性高铁血红蛋白血症（RCM）是一种常染色体隐性遗传性疾病。通常是由患者的NADH-细胞色素b5还原酶（b5R）缺陷所致。近年来通过对该病的患者进行生物化学、免疫学及分子生物学研究。共发现6种新的突变基因型（R57Q，L72P、C203Y、R60H、M176T和P264L）。为了探讨b5R基因突变引起RCM的分子病理机制，研究突变型b5R蛋白结构和功能的关系，我们构建了野生型pGST-b5R和突变型pGST—b5RL72P表达载体，并在大肠杆菌中表达，获得了纯化的GST—b5R和GST—b5RL72P蛋白，为研究该突变对b5R酶的影响打下了基础。

NADH-细胞色素b5还原酶缺陷与隐性先天性高铁血红蛋白血症

NADH-细胞色素b5还原酶(简称b5R),是一种在体内广泛分布,具有重要生理功能的氧化还原酶类。b5R基因突变可导致b5R酶活性的降低,而b5R缺陷将导致隐性先天性高铁血红蛋白血症(RCM)。本文就b5R研究的某些进展及与RCM的关系作一介绍。

NADH─细胞色素b_5还原酶在甲状腺过氧化氢生物合成中的作用

应用高香草酸荧光分析技术及NADH─高铁氰化钾还原酶法对正常和Graves病甲状腺过氧化氢(H2O2)和NADH─细胞色素b5还原酶(b5R)进行测定， 发现Graves病甲状腺b5R活性和H2O2水平均明显高于正常, 而H2O2酶活性在Graves病和正常甲状腺间无显著差异。加b5R 抑制剂对氯汞苯甲酸后，Graves病和正常甲状腺b5R活性降低近85%，同时H2O2降低50％。b5R活性和H2O2水平两者呈显著正相关关系。以上结果表明b5R参与甲状腺内H2O2的生物合成,是甲状腺内H2O2生成的重要酶系。

指状青霉cyt b_5和cyt b_5r基因克隆及与cyp51A的共表达

为探究指状青霉细胞色素b5(Cyt b5)与细胞色素b5还原酶(Cyt b5r)在细胞色素P450 CYP51A电子传递方面的功用,研究了指状青霉CYP51A与Cyt b5-Cyt b5r共表达机制;并检测了其对于cyp51A基因表达水平的影响。通过转录组分析筛选并PCR克隆获得了cyt b5与cyt b5r基因,分别命名为HS-Pdcyt b5和HS-Pdcyt b5r。以多基因串联克隆载体p PICZαA为骨架构建了指状青霉共表达质粒ppbr A(p PIC-Pdcyp51A-cyt b5-cyt b5r);电转化法将重组质粒ppbr A导入毕赤酵母X-33中。q RT-PCR分析结果显示,CYP51A与Cyt b5-Cyt b5r共表达后,其基因表达水平升高54%-97%,并维持较长时间(48-72 h)。表明Cyt b5-Cyt b5r系统可将电子高效转移给CYP51A,从而增强cyp51A基因的转录表达。从指状青霉中克隆表达HS-Pd Cyt b5和HS-Pd Cyt b5r蛋白,并通过共表达的方式研究cyp51A基因的功能尚为首次报道。

高铁肌红蛋白还原酶及其对肉色稳定性的作用综述

概述了高铁肌红蛋白还原酶的研究经历、命名,以及几种被人们所识别的高铁肌红蛋白还原酶,阐述了NADH-细胞色素b5还原酶的分子量、细胞定位及还原高铁肌红蛋白的机理,综述了高铁肌红蛋白还原酶的酶学特性,对高铁肌红蛋白还原酶在稳定肉色方面可能起到的作用进行了讨论。

高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶I的克隆、表达和功能鉴定

【目的】鉴定产油微生物高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶Ⅰ的功能。【方法】将高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b_5还原酶Ⅰ基因与人可溶性细胞色素b_5还原酶基因序列比对,去除该基因N端穿膜区域后,与人可溶性细胞色素b_5基因分别在大肠杆菌中异源表达;通过钴离子亲和层析、离子交换和分子排阻色谱等方法对表达产物进行纯化;以2,6-二氯靛酚钠(DCIP)为底物,测定细胞色素b_5还原酶Ⅰ的体外活性及其对NADH和NADPH的偏好性;在反应体系中存在NADH时,通过全波长扫描方法检测细胞色素b_5还原酶Ⅰ与细胞色素b_5的相互作用。【结果】高山被孢霉ATCC 32222中膜结合细胞色素b_5还原酶Ⅰ被成功可溶表达,经纯化后检测到体外活性:使用NADH时酶活为564.57 U,使用NADPH时为51.97 U;在NADH存在时,细胞色素b_5还原酶Ⅰ能够还原细胞色素b_5,其吸收峰从411 nm偏移至422 nm,并在521 nm和554 nm处吸光值增加。【结论】细胞色素b_5还原酶Ⅰ N端穿膜区域的去除增加了其可溶性,并保持了蛋白质活性;高山被孢霉ATCC 32222中细胞色素b_5还原酶Ⅰ基因编码的是一种NADH-细胞色素b_5还原酶,其在体外能与细胞色素b_5相互作用。

中国人遗传性高铁血红蛋白血症患者中一个新的突变基因型的鉴定

目的:报道一例遗传性高铁血红蛋白血症患者还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素b5还原酶(b5R)基因突变情况。方法:采用逆转录-聚合酶链反应产物直接测序法,分析遗传性高铁血红蛋白血症患者b5R基因的cDNA全部编码序列;PCR结合限制性内切酶(PvuⅠ和AfaⅠ)酶切,分析患者和她的家庭成员b5R基因组DNA扩增片段。结果:两个b5R等位基因中,一个存在M176T(ATG→ACG)突变,另一个存在C203Y(TGC→TAC)突变,其中M176T(ATG→ACG)为新发现的b5R基因突变。结论:本研究鉴定的M176T/C203Y复合杂合子突变是该遗传性高铁血红蛋白血症患者的致病基础。