乙型肝炎病毒X蛋白增强人血管生成因子bFGF基因启动子转录活性

目的检测乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对人血管生成因子bFGF基因转录的激活作用并确定其作用于bFGF基因启动子的区域,分析HBx激活bFGF基因转录可能的分子机制,为揭示HBx促进肝癌发生的分子机制及发现新的治疗靶点。方法运用高保真DNA聚合酶从人肝癌HepG2细胞cDNA文库中扩增出bFGF基因启动子DNA序列;从含完整HBV DNA序列的表达载体中扩增HBx编码序列并克隆入真核表达载体p CDNA3-FLAG中,将HBx表达载体转染人肝癌HepG2细胞中,裂解细胞进行蛋白SDS-PAGE电泳,Western blot检测HBx蛋白的表达;将HBx表达载体和含bFGF基因启动子不同区段的荧光素酶报告载体共转染肝癌HepG2和SMMC-7721细胞,检测HBx对bFGF基因启动子转录活性的影响;运用Western blot检测在肝癌细胞中HBx过表达对ERK磷酸化的影响。结果成功克隆了HBx并使其在肝癌细胞中得到表达;成功克隆了bFGF基因启动子2.2 kb、1.4 kb、720 bp和360 bp的区段;在肝癌细胞SMMC-7721和HepG2细胞中HBx的表达能升高bFGF基因启动子的活性,且对上述4个区段的活性均增加约5倍;HBx以剂量依赖的方式增强bFGF基因启动子的活性;HBx高表达在肝癌HepG2细胞中不能升高ERK1/2的磷酸化水平。结论HBx能够激活bFGF基因启动子的活性,这种激活作用位于HBx启动子转录起始位点上游360 bp片段内,HBx促进bFGF基因转录不依赖于ERK1/2的磷酸化作用,提示HBx可能通过其它信号通路作用于bFGF基因的转录过程。

bFGF基因转染促进股骨头坏死修复的实验研究

目的 :为临床治疗股骨头及其它骨缺血性坏死探索新方法。方法 :将碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)真核表达质粒pCD rbFGF与胶原混合植入坏死的兔股骨头内 ,术后RT PCR及免疫组化方法检测bFGF表达情况 ,组织切片及组织形态学分析股骨头内血管生长及新骨形成情况。结果 :术后 2周RT PCR及免疫组化证实转染bFGF基因的股骨头内有bFGF表达。术后 2周股骨头内血管生长与对照组相比 ,术后 8周股骨头内新骨形成与对照组相比 ,差异均有非常显著意义 (P <0 .0 1)。结论 :利用bFGF基因转染可刺激股骨头坏死内血管再生和新骨形成 。

骨髓基质干细胞BMP-2和bFGF基因的联合修饰

目的:建立能够稳定表达BMP-2及bFGF的骨髓基质干细胞,优化骨组织工程种子细胞。方法:通过RT-PCR方法获取全长BMP-2及bFGF基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.0,鉴定正确后,经脂质体介导导入分离培养的大鼠骨髓基质干细胞,G418筛选稳定表达株。利用RT-PCR、Westernblot、ELISA、免疫组织化学染色方法分析转染细胞外源基因表达情况。结果:成功构建了全长BMP-2及bFGF的真核表达载体,转染大鼠骨髓基质干细胞后经G418筛选获得稳定表达株。RT-PCR结果显示稳定转染细胞中具有大量目的基因mRNA转录,ELISA检测培养上清中目的蛋白表达阳性,Westernblot、免疫组化结果显示胞质中有目的蛋白的表达。结论:获得了可以稳定表达BMP-2及bFGF的骨髓基质干细胞,有利于组织工程骨缺损修复中的应用。

黄芪失笑散对实验大鼠梗死心肌内VEGF及bFGF mRNA基因表达的影响

目的:黄芪失笑散对梗死心肌内血管内皮细胞生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA基因表达影响。方法:取SD大鼠76只,随机分成假手术组、模型组、消心痛组、黄芪失笑散小剂量组、黄芪失笑散大剂量组、消心痛加黄芪失笑散大剂量组、贝复济组。治疗20天后进行冠状动脉结扎造成急性心梗的模型,造模成功后再治疗10天后,处死大鼠,取梗死心肌用RT-PCR法进行VEGF及bFGF mRNA的检测。结果:黄芪失笑散大剂量可有效的使梗死心肌内的VEGF及bFGF的mRNA表达升高,并提示黄芪失笑散疗效呈剂量依赖性。结论:黄芪失笑散对缺血性心肌保护作用源于冠脉侧枝循环血管新生。

bFGF基因修饰的骨髓基质细胞复合多孔矿化Bio-Oss胶原修复下颌骨缺损的实验研究

目的:观察经bFGF基因转染的兔骨髓基质细胞复合多孔矿化Bio-Oss骨胶原修复下颌骨缺损的效果。方法:标准成年新西兰白兔12只随机分3组,单纯Bio-Oss骨胶原组,BMSCs+凝胶+Bio-Oss骨胶原组,bFGF基因转染BMSCs+胶原+Bio-Oss骨胶原组于术后8周取材,行肉眼、组织学观察骨缺损的修复情况。结果:单纯Bio-Oss骨胶原材料组:缺损区大量的未吸收的支架材料周围可见有类骨样组织;BMSCs+凝胶+Bio-Oss骨胶原材料组:缺损区大量的未吸收的支架材料周围可见有大量间充质细胞聚集、分化,有较幼稚的编织骨形成;bFGF基因转染BMSCs+凝胶+Bio-Oss骨胶原材料组:支架材料周围,大量新骨形成,新骨表面可见活跃的成骨细胞,部分区域有成熟骨组织形成,并有新生的毛细血管形成。结论:Bio-Oss骨胶原有较强的诱导成骨能力;Bio-Oss骨胶原为载体的自体骨髓基质细胞移植能有效修复骨缺损,是骨组织工程良好的支架材料;兔骨髓基质细胞体外表达人bFGF基因,并且经基因修饰的组织工程骨修复骨缺损效果最佳。

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子 (basicFibroblastGrowthFactor ,简称bFGF)的真核表达载体 ,以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用 .应用基因重组技术 ,将已经克隆的bFGF基因从PBR32 2_bFGF载体上亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.1上 ,构建的重组质粒经脂质体介导转染 3T3细胞 ,36h后观察瞬时表达情况 .酶切 ,PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性 ;免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况 ,结果显示部分经转染的细胞呈阳性 (棕色颗粒 ) .结果表明已成功地构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1_bFGF ,并且bFGF能够在

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor ,bFGF)的荧光真核表达载体 ,以便进一步转染成骨细胞 ,研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术 ,将已经克隆的bFGF基因从PBR3 2 2 -bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP -C3 ,构建的重组质粒经脂质体介导转染 3T3细胞 ,3 6h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况 ,观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光 ;免疫组化检测bFGF的表达分泌情况 ,结果显示部分经转染的细胞呈阳性 (棕色颗粒 )。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP -C3 -bFGF ,并在 3T3细胞中表达了bFGF。

抗rh-bFGF嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的 :构建并在真核细胞中表达抗人重组碱性成纤维生长因子 (rh bFGF)人 鼠嵌合抗体。方法 :从分泌抗rh bFGF鼠单抗(mAb) 1F11的杂交瘤细胞中扩增、克隆VL、VH 基因 ,从质粒pMDHC和pMDLC中扩增、克隆CL、CH 基因 ,测序鉴定后插入真核表达载体 ,并转化二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO dhfr- )细胞进行表达。采用间接ELISA检测表达产物的人源性和其抗原结合活性。结果 :序列测定表明所克隆的抗体基因是功能性抗体的V区基因 ,在转化细胞的培养上清中可检测到抗rh bFGF嵌合抗体的表达。ELISA试验证实 ,该嵌合抗体具有人源C区 ,并具有鼠mAb 1F11的抗原结合活性。结论 :在真核细胞中成功地表达抗rh bFGF的人 鼠嵌合抗体 。

脂质体介导的bFGF-EGFP基因在前庭上皮支持细胞中的表达及生物学作用

目的探讨脂质体介导的bFGF基因在前庭上皮支持细胞中的表达情况及生物学作用。方法利用脂质体将携带绿色荧光蛋白的bFGF基因质粒导入前庭上皮细胞内,利用绿色荧光蛋白的表达以及RT-PCR技术检测基因的表达,并利用免疫组织化学等形态学技术手段观察其生物学作用。结果脂质体介导的bFGF基因在细胞内表达良好,转染成功的细胞形态发生明显变化,但MyosinⅦa表达阴性。结论脂质体介导的bFGF基因可以在前庭上皮细胞内获得良好表达,并促使细胞形态向毛细胞转化。

bFGF与VEGF抗原表位筛选及复合肽的表达鉴定

目的筛选bFGF与VEGF抗原表位,构建复合肽进行原核表达,并对复合肽免疫原性及抑瘤效果进行研究。方法生物信息学方法分别预测bFGF和VEGF抗原表位,筛选优势表位,通过柔性Linker连接各表位构建复合肽,合成引物,重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)方法合成复合肽cDNA序列,克隆入原核表达载体pET32a进行表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western-Blot鉴定,Ni-NTA柱纯化复合肽并免疫小鼠,间接ELISA法测定抗bFGF抗体和抗VEGF抗体滴度。构建黑色素移植瘤C57BL/6小鼠模型,研究复合肽免疫后肿瘤生长情况。结果生物信息学方法筛选获得3个bFGF表位和2个VEGF表位连同一个噬菌体多肽库筛选表位构建成复合肽,SOEPCR方法成功合成复合肽cDNA序列,构建原核表达载体表达bFGF与VEGF复合肽,纯化的复合肽免疫小鼠产生抗bFGF抗体和抗VEGF抗体;并且体内能有效抑制黑色素瘤生长。结论生物信息学方法筛选bFGF和VEGF获得的抗原表位构建的复合肽在体内同时激发抗bFGF抗体和抗VEGF抗体,并且能抑制肿瘤的生长,为研究bFGF与VEGF表位的抗肿瘤作用奠定基础。

bFGF真核表达载体构建后分泌表达促进颌骨种植体周围骨缺损的研究

目的构建研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测。同时利用bFGF基因修饰的组织工程骨移植修复颌骨种植体周围的骨缺损。方法从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR获得bFGF cDNA。测序证实其结果正确后,构建真核表达载体。并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定。利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bF GF基因同源的序列。通过脂质体将重组质粒转染骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),使用间接免疫荧光法进行表达产物检测。应用基因重组技术使bFGF重组质粒转染BMSCs,筛选出阳性细胞后,复合以多孔矿化骨移植修复颌骨种植体周围骨缺损。通过对缺损处形态及X线、组织学等检查进行评价。同时以外源性注射bFGF修复缺损组作为对照。结果 bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1-bFGF中编码bFGF的序列与基因库中的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光表达产物检测结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。bFGF基因修饰的组织工程骨成骨能力较外源性注射bFGF组更强,周围的毛细血管大量增殖,骨髓腔通畅,骨缺损完全愈合。结论成功地构建人bFGF真核表达载体,并且此载体可以在体外进行表达。bFGF基因修饰的骨髓基质干细胞所形成的组织工程骨成骨能力更强,对修复颌骨种植体周围骨缺损极其适合。

抗bFGF McAb制备、鉴定及轻链可变区基因克隆和序列分析

目的：以重组人碱性成纤包生长因子为抗原免疫小鼠，建立多株稳定分泌ｂＦＧＦ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞。半对ｂＦＧＦ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）可变区基因进行扩增及序列分析。方法：采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法和免疫沉淀法对抗体特异性和ｌｇ类型进行鉴定，同时，应用分子生物学技术，对Ｖｋ基因的ＤＮＡ片段进行克隆，并对４ａ２Ｖｋ基因进行序列测定。结果：ｂＦＧＦ单克隆抗体可特异性结合人重组ｂＦＧＦ抗原。

rhbFGF基因及其蛋白促兔缺血心肌血管新生的对比研究

目的 探讨通过心肌内注射重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)基因及其蛋白促兔缺血心肌血管新生的“基因血管搭桥”的效果。方法 无菌条件下开胸结扎兔冠状动脉左前降支(LAD),建立急性心肌梗死动物模型。将成功构建的真核表达质粒pcDNA_3-bFGF、rhbFGF蛋白、生理盐水,直接四点注射入兔缺血心肌内。实验兔饲养6周、12周以后,通过病理切片光镜观察、图像分析对比研究三组间血管新生情况。结果 1)成功构建pcDNA_3-bFGF真核表达质粒并制备rhbFGF蛋白;(2)pcDNA_3-bFGF真核表达质粒在心肌中成功表达为rhbFGF蛋白;(3)血管新生的观察:通过对心肌内注射基因及其蛋白进行对比研究,发现心肌内注射蛋白和基因均有促兔缺血心肌血管新生的作用,而基因的促血管新生作用更强。结论 rhbFGF蛋白及基因心肌内注射均有促兔缺血心肌血管新生的作用,而基因的促血管新生效果显著。“基因治疗促血管新生”法是另一种有效的冠心病治疗方法,rhbFGF基因有重要的推广应用价值。

bFGF、αⅤβ3和NFκB在hOEC中的表达及其与血管生成关系的研究

目的:研究碱性成纤维生长因子(bFGF)、整合素αⅤβ3和核因子κB(NFκB)在人卵巢上皮性癌(OEC)组织中的表达及其与血管生成的关系·方法:原发性人卵巢上皮癌(hOEC)36份、卵巢良性肿瘤及正常卵巢15份,应用免疫组化方法(ABC法)检测bFGF、整合素(integrin)αⅤβ3、NFκB、微血管密度(microvesseldensity,MVD)在OEC、卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织中的表达及其与临床病理特征的关系.结果:bFGF、αⅤβ3、NFκB和MVD在各种组织中的表达,36份OEC中的阳性表达率分别为66·67%、66·67%、72·22%和(43·98±33·73),在良性肿瘤组织中的表达率分别20·00%、6·67%、26·67%和(13·08±9·07);在正常卵巢组织的表达率分别为0·00%、0·00%、13·33%和(7·10±5·42),OEC组各指标的阳性率均显著高于良性卵巢肿瘤组及正常对照组(P<0·05).OEC中bFGF、αⅤβ3、NFκB、MVD随着肿瘤分化程度的降低、FIGO分期的增加、肿瘤转移范围扩大,各指标的表达均逐步增高(P<0·05).OEC中bFGF、αⅤβ3、NFκB与MVD的表达的相关系数分别为0·69、0·67、0·62、各指标与MVD均显著相关(P<0·01).NFκB阳性表达者bFGF、αⅤβ3的阳性表达率分别为92·86%和85·71%,显著高于NFκB阴性表达者bFGF、αⅤβ325%的表达率(P<0·05).结论:bFGF,αⅤβ3,NFκB在OEC中的表达显著增高,与OEC血管生成密切相关.bFGF、αⅤβ3在OEC中的表达与NFκB表达呈正相关,NFκB可能通过对bFGF、αⅤβ3的正向调节作用,进而影响OEC血管生成.

人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)cDNA的克隆

为了研究人碱性成纤维细胞生长因子在治疗神经系统疾病中的作用 ,克隆其 c DN A序列 ,并添加 K ozak序列 ,以用于真核细胞表达。本实验提取我国自建的脑胶质瘤细胞系 BT32 5总 RN A,设计上、下游引物用逆转录 PCR法扩增 c DNA片段 ,然后重组于 p GEM- 3zf( + )载体 ,酶切鉴定插入片段正确后测序。结果 :RT- PCR扩增到 4 73bp的带有 K ozak序列的 c DN A片段。显示 :克隆到碱性成纤维细胞生长因子 c DN A片段 。

bFGF-Math1基因诱导UEC-4细胞产生毛细胞的实验研究

目的进一步探讨bFGF-Math1基因在前庭上皮细胞系(UEC-4)细胞中的表达及生物学作用。方法利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导bFGF-Math1基因真核表达质粒(pCI-bFGF-Math1)转染UEC-4细胞,利用RT-PCR技术检测基因在细胞中的表达,并利用免疫组织化学方法观察细胞的分化及特异性抗体的表达。结果脂质体介导的基因可在细胞内获得良好的表达,转染后24h,相差显微镜下观察细胞形态发生变化,免疫组织化学显示转染后细胞可以表达毛细胞特异性蛋白Myosin7a。结论bFGF-Math1基因有良好的生物学特性,可以有效地诱导支持细胞向毛细胞样细胞转变。

农杆菌介导法将bFGF基因转入木立芦荟的初步研究

利用农杆菌介导法将bFGF基因导入木立芦荟中,通过对农杆菌介导芦荟遗传转化影响因素的分析,建立了优化的芦荟转化体系。用继代培养获得的粗壮的芦荟单株茎段作为转化外植体,以OD=0.55~0.68的EHA105农杆菌工程菌液侵染25 min,在MS＋蔗糖10 g/L＋100μmol/L乙酰丁香酮的共体培养基上培养3 d,在MS＋6-BA 3 mg/L＋头孢霉素400 mg/L＋卡那霉素80 mg/L的筛选培养基上培养60 d,然后转至MS＋6-BA 2 mg/L＋NAA 0.15 mg/L的分化培养基进行培养,生根后移栽。通过PCR初步检测,并经Southern杂交进一步证明外源基因bFGF已经整合到芦荟的基因组中。

bFGF基因转染MSC目的基因检测

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)基因外源性转染到MSC(骨髓间充质细胞)后,b FGF基因的表达情况。方法选取SD大鼠,获取骨髓间充质细胞,分为对照组、阴性对照组(转染外源性GFP)和实验组(外源性b FGF转染MSC),经过体外培养后,应用RT-PCR和ELISE法检测各组MSC的b FGF基因阳性表达情况。结果 RT-PCR法显示实验组b FGF基因表达量(0.73±0.15)高于对照组和阴性对照组(P<0.05)。ELISA法显示b FGF基因表达主要集中在胞浆,实验组b FGF基因表达量[上清为(5.38±0.45)ng/L,胞浆为(8.27±0.82)ng/L]高于其他两组(P<0.05)。结论采用病毒介导基因转染技术能够将外源性b FGF转染至MSC,并能够成功实现b FGF基因表达。

高表达p73基因抑制肺腺癌细胞VEGF、bFGF mRNA表达

目的 观察高表达的p73基因对肺腺癌细胞生长曲线以及血管内皮生长因子 (VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)mRNA表达水平的影响 ,探讨高表达 p73基因在肺腺癌血管生成中的作用。 方法 将 p73α、p73 β以脂质体法转染A5 49细胞、H12 99细胞 ,采用细胞计数法绘制转染前后两种细胞生长曲线 ,RT PCR法半定量分析转染前后两种细胞中VEGF、bFGFmRNA的表达水平的变化。结果 转染p73基因后 ,A5 49细胞、H12 99细胞生长受到抑制 ,VEGF、bFGFmRNA表达水平下降 ,较未转染 p73基因的细胞有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,其中 p73 β对VEGFmRNA表达的抑制作用更为显著 (P <0 .0 1)。 结论 高表达的 p73基因能够抑制肺腺癌细胞生长 ,降低肺腺癌细胞中VEGF、bFGFmRNA表达水平 ,提示高表达的 p73基因可能参与调控人肺腺癌VEGF和bFGF基因表达 。

胶质瘤bFGF基因表达与增殖活性的相关性研究

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）的异常表达与胶质瘤的恶性程度和增殖活性的关系。方法采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和免疫组化法对５７例人脑胶质瘤进行ｂＦＧＦ基因表达及Ｋｉ－６７标记指数检测及相关性分析。结果各组胶质瘤均有ｂＦＧＦｍＲＮＡ表达，且表达水平以恶性胶质瘤为高。Ｋｉ－６７标记指数在胶质瘤中升高显著。ｂＦＧＦｍＲＮＡ表达水平与胶质瘤恶性度及Ｋｉ－６７标记指数呈正相关。结论ｂＦＧＦ与胶质瘤的恶性进展有关，可作为判定胶质瘤恶性度的指标之一。