Bacillus subtilis Z-5产果胶酶发酵条件的优化及其应用

为进一步提高果胶酶的产量,采用响应面法优化了Bacillus subtilis Z-5产果胶酶的发酵培养基和发酵条件,并将优化后得到的果胶酶应用于梨汁澄清实验。通过单因素实验探究9个因子对B.subtilis Z-5产果胶酶活力的影响,然后采用Plackett-Burman试验设计筛选出3个显著影响产酶的因素:酵母粉含量、pH、培养时间;再结合响应面设计法确定了最佳的发酵条件。结果表明最佳的发酵培养基成分是果胶10 g/L,酵母粉7.99 g/L,MgSO_(4)·7H2O 0.5 g/L;最佳的发酵条件为初始pH5.66,发酵温度37℃,培养时间72 h,接种量为6%(v/v),装液量50/250 mL,底物浓度为10 g/L;在此基础上,B.subtilis Z-5产果胶酶酶活力由879.00 U/mL提高到1549.62 U/mL,是优化前的1.76倍。在梨汁澄清实验中表明果胶酶的最适添加量为4 mL,最适酶解时间为2.5 h,最适酶解温度为65℃,最适酶解pH为6.0,此时透光率最大为79.77%,与商品酶相比,自制果胶酶是一种具有多种酶系复合酶,可作用于梨汁中含有的蛋白、淀粉等其他成分,使得梨汁更加澄清。本研究结果为果胶酶的工业化生产和应用提供了理论支撑。

芽孢杆菌ZJM-P5与氮配施对红小豆幼苗生长和氮吸收的影响

以红小豆品种‘晋红小豆5号’和促生芽孢杆菌ZJM-P5为材料,设置不同氮素用量和菌液浓度处理,采用盆栽试验,测定各菌氮处理下红小豆幼苗农艺性状、生理特性及含氮量等指标,研究促生芽孢杆菌ZJM-P5与氮配施对红小豆幼苗生长发育的影响,并筛选出最佳促生菌液浓度水平,为提高红小豆幼苗的养分吸收利用效率及其高产优质栽培提供理论依据。结果表明:(1)在同一菌液浓度下,红小豆苗期株高、茎粗、叶面积、地上部干重、根系干重、根表面积、根系体积、根系平均直径均随施氮量的增加呈先升高后降低的趋势,而最大根长随着施氮量增加有所下降;根系可溶性糖及MDA含量随施氮量增加均呈先降后升的趋势;根系SOD、POD活性及根系活力均随施氮量增加先升高后降低;根系可溶性蛋白含量、NR活性和植株含氮量均随施氮量增加而增加。(2)在相同施氮量条件下,除根系可溶性糖和MDA含量随着菌浓度的增加先下降后升高外,其余各指标均呈先升后降的变化趋势;各指标除低氮(50mg·kg^(-1))水平下在10~8 cfu·mL^(-1)菌液浓度达到最大值外,其它氮水平均在10~7 cfu·mL^(-1)菌液浓度达到最大值。研究发现,芽孢杆菌ZJM-P5与氮合理配施有利于红小豆植株的氮素吸收和生长发育,并以100mg·kg^(-1)为最佳施氮(纯氮)水平,10~7 cfu·mL^(-1)为最佳菌浓度,且两者组合处理的幼苗农艺性状、根系活力及保护酶活性、氮素含量均达到较高水平;过量施氮、施菌或菌氮比例不合理则会导致幼苗干物质积累及氮素提升受限,进而抑制植株正常生长。

不同氮、腐殖酸肥施用量下芽孢杆菌ZJM-P5对红小豆幼苗根际土壤酶活性的影响

通过盆栽试验研究2种肥料(氮肥和腐殖酸肥)不同施用量与芽孢杆菌ZJM-P5菌悬液组合处理对红小豆幼苗根际土壤酶活性的影响,为红小豆经济合理施肥和微生物肥料菌种选育提供理论依据。结果发现,(1)同一施肥水平下,2种栽培环境下的土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性均随菌悬液浓度的增大呈先升高后降低的趋势,其中脲酶活性均在10~7 CFU/mL浓度下达最大值,蔗糖酶活性除0、50 mg/kg施氮处理外其他施肥水平均在10~7 CFU/mL浓度下达最大值,而过氧化氢酶活性均在10~8 CFU/mL时最大。(2)相同菌悬液浓度下,与不施肥处理相比,施氮、腐殖酸肥处理的脲酶活性均随施肥量的增加呈升高趋势;施氮处理的蔗糖酶活性在0、10~6 CFU/mL浓度下随施氮量的增加而增大,在10~8 CFU/mL和10~9 CFU/mL下不同施氮处理的酶活性接近,10~7 CFU/mL浓度下在100 mg/kg施氮处理时酶活性显著高于其他处理,而过氧化氢酶活性随施氮量的增加先增大后减小,在100 mg/kg时酶活性最大;腐殖酸肥处理的蔗糖酶活性随施肥量的增加呈先升后降的趋势,在0.67 g/kg处理下酶活性最大,而过氧化氢酶活性随施肥量的增加逐渐增大。(3)相同菌悬液浓度下2种栽培环境间土壤酶活性结果比较得出,施用腐殖酸效果优于化学氮肥。研究结果表明,对于种植红小豆来说,芽孢杆菌ZJM-P5菌悬液浓度为10~7～10~8 CFU/mL为最佳菌浓度,纯氮量为100 mg/kg、腐殖酸量0.67 g/kg为最佳施肥量,合理浓度的菌悬液和肥料组合处理可以更大作用地发挥土壤酶的生物学活性。

芽孢杆菌ZJM-P5与磷肥互作对红小豆根系及产量的影响

为明确芽孢杆菌ZJM-P5与磷肥互作对红小豆根系发育和产量的影响,于2016和2017年以‘晋红5号’红小豆为材料,设置磷肥施用量[50(P1)、100(P2)、200(P3)mg·kg^-1]和菌液浓度[106(A1)、107(A2)、108(A3)、109(A4)cfu·mL^-1]两因素复合处理,以菌磷皆不施为对照(CK),采用盆栽试验分析芽孢杆菌ZJM-P5与磷互作下红小豆幼苗根系形态、生理特性及产量的变化。结果表明:(1)各芽孢杆菌ZJM-P5与磷肥复合处理(磷菌互作)均显著提高了红小豆幼苗主根长、根面积、根体积(P<0.05),幼苗主根长和根冠比均在P1A3处理下最高,分别比CK显著提高83.1%和50.9%,根面积和根体积均在P2A2处理下最高,分别比CK显著提高69.7%和54.2%。(2)各磷菌互作处理均显著提高了红小豆幼苗根系SOD活性、POD活性、根系活力和可溶性蛋白含量,且均在P2A2处理时达到峰值,并显著降低红小豆幼苗根系MDA和可溶性糖含量,且均在P2A2处理下达到最低值。(3)各磷菌互作处理均显著提高了红小豆幼苗植株P含量,并显著降低了根系酸性磷酸酶活性;随着施磷量增加,植株P含量逐渐增加,根系酸性磷酸酶活性逐渐降低;随着菌液浓度的增加,植株P含量和根系酸性磷酸酶活性均先升后降且均在A2浓度下最高。(4)随着施磷水平或者菌液浓度的增加,红小豆百粒重和籽粒产量均呈先增大后减小的趋势;各磷菌互作处理均显著提高了红小豆百粒重和籽粒产量,且均在P2A2处理组合下增产效果最佳,比对照分别显著增长了141.60%和210.40%。研究发现,芽孢杆菌ZJM-P5与磷肥互作处理可通过改变红小豆幼苗根系构型、提高根系活力、改善根系生理机能来提高红小豆的籽粒产量,且在100 mg·kg^-1施磷量、107cfu·mL^-1菌液浓度互作下可达到最佳促生增产效果。

CA12-5联合月经血结核分枝杆菌检测对女性生殖系统结核诊断价值研究

目的探讨月经血结核分枝杆菌荧光定量PCR检测(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)联合血清糖类抗原12-5(CA12-5)对女性生殖器结核(female genital tuberculosis,FGT)的诊断价值。方法回顾性分析2018年1月—2021年12月本院收治的160例输卵管性及不明原因不孕、复发性流产者,根据内镜下所见表现及病理检测结果,分析月经血结核分枝杆菌FQ-PCR及外周血清CA12-5含量(<35U/L)的检测效能,同时比较与血清结核分枝杆菌FQ-PCR阳性率及检测时长方面的优势。结果FQ-PCR及CA12-5联合检测对生殖器结核漏诊率为12.82%,低于月经血结核分枝杆菌FQ-PCR检测单独检测的64.10%与CA12-5的35.90%以及血清结核分枝杆菌FQ-PCR的7.18%,同时联合检测时间低于常规检查(培养及胸腔镜下检查)时间(均P<0.05)。结论无创月经血结核分枝杆菌FQ-PCR检测联合外周血清CA12-5在女性生殖器结核诊断方面较单一检测手段诊断效能高,漏诊率低,缩短检测时长,具有一定的临床实用价值。

能降解天然纤维素的地衣芽孢杆菌GXN151的分离鉴定及其一个纤维素酶基因(cel5A)的克隆和测序分析

从广西大学农场陈旧稻草堆中分离出1株具有降解天然纤维素稻草粉、甘蔗渣粉活性的细菌GXN151,经形态观察、16SrDNA序列分析和丙酸盐利用试验将其鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。通过连接经BamHI酶切的pBluescriptKS(+)和回收得到的经Sau3AI部分酶切的GXN151的3～10kbDNA在大肠杆菌JM109中构建了该菌的含7099个克隆的基因文库,文库克隆中插入片段最大的为11.0kb,最小的为3.1kb,平均大小为4.6kb,含GXN151基因组中任一基因的概率P为99.6%。筛选该文库获得8个表达羧甲基纤维素酶活性的克隆,DNA测序和PCR分析表明,该8个克隆可归为3类不重叠的独立克隆,其中一个克隆pGXNL2的测序分析表明其上的cel5A基因为1626bp,可编码含542个氨基酸的羧甲基纤维素酶,Cel5A的N-末端的42个氨基酸具有信号肽特征,它的第66～321氨基酸为家族5糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域、第391～472氨基酸为家族3碳水化合物结合组件(carbohydrate-bind-ingmodule,CBM)。本工作首次报道地衣芽孢杆菌能降解结晶纤维素及从该种细菌中克隆到纤维素酶基因。

微生态制剂对幼兔生长及HPA轴5-HT能细胞的影响

本文旨在研究微生态制剂对幼兔生长和下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴5-羟色胺(5-HT)免疫反应细胞的影响。选用108只雄性幼兔随机分为4组:对照组饲喂基础日粮,益生素组在日粮中添加0.1%蜡样芽孢杆菌PAS38制剂,益生元组在日粮中添加0.2%甘露聚糖制剂,合生元组在日粮中添加0.1%蜡样芽孢杆菌PAS38制剂和0.2%甘露聚糖制剂。其中48只兔(每组12只,每4只为1个重复)用于全程观察生长性能,其余60只家兔饲喂至60、75和90日龄时每组宰杀5只,采用免疫组化法检测HPA轴5-HT阳性细胞数量和表达。结果表明,益生素组和合生元组日增重极显著高于对照组(P<0.01),益生元组显著高于对照组(P<0.05)。益生素、益生元、合生元组的料重比分别比对照组下降了13.8%、10.9%、14.9%(P>0.05)。微生态制剂对HPA轴5-HT阳性细胞数量变化不显著(P>0.05);75日龄和90日龄时,益生素和合生元组HPA轴5-HT阳性细胞的表达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组,益生元组90日龄时HPA轴5-HT阳性细胞的表达显著高于对照组(P<0.05)。结果提示,微生态制剂能促进幼兔生长,增强HPA轴中5-HT阳性细胞的表达。

苏云金杆菌SD-5菌剂防治大豆银纹夜蛾的研究

试验结果表明Bt SD-5对银纹夜蛾幼虫具有高毒力,纯化晶体的毒力比孢品混合物高,毒杀速度也较快;SD-5对银纹夜蛾化蛹和羽化均有明显影响;田间小区药效试验表明SD-5 0.2×10~8、0.5×10~8、1×10~8活芽孢/mL 6天的防效分别为90.1%、96.9%和97.8%;示范推广123.6hm^2,平均防效为91.85%;SD-5处理区天敌种类和数量明显高于化防区;SD-5田间喷施后第8天毒效下降至10.3%,毒效下降呈不匀速性。

苏云金杆菌SD－5菌剂对豆天蛾的防治研究

利用ＳＤ－５菌剂对豆天蛾系统地进行了室内毒力测定，不同龄期敏感性试验，对卵的毒力试验，田间药效试验，示范及推广。结果：孢晶混合物和纯化晶体感染３龄虫７２ｈＬＣ５０分别为３．０２×１０￣６个孢晶／ｍｌ和１．８６×１０￣６个晶体／ｍｌ，且晶体致死速度较快；不同龄期的幼虫对ＳＤ－５菌剂敏感性有一定差异，小龄虫更为敏感。喷施ＳＤ－５菌剂对豆天蛾卵的孵化无明显影响，但孵出的幼虫４８ｈ内死亡率高达９１．６％～１００％；田间小区试验ＳＤ－５０．５亿／ｍｌ防效为９１．７％，优于７２１６；大田示范推广１２５．４８ｈｍ￣２．防效达９２．３５％～９８．７３％；ＳＤ－５防区内天敌种类和数量明显高于化防区。

苏云金杆菌00-50-5发酵上清液对南方根结线虫杀虫活性研究

室内条件下,分别测定了苏云金杆菌Bt 00-50-5菌株液体和固体发酵物对南方根结线虫的毒力效果。结果显示,牛肉膏蛋白胨液体发酵法在72h所得上清液的毒性最高,南方根结线虫死亡率达到99.0%,而固体麸皮发酵物对线虫的最高毒性为发酵8h,南方根结线虫死亡率为89.0%。液体发酵上清液经葡聚糖凝胶G-75柱层析分离,柱下物在280nm处的吸收值呈现出4个峰I、II、III和IV,其值0.601,1.475,1.641和0.392,其中峰II、III、IV处收集的蛋白对南方根结线虫有毒杀作用,分子量最小的IV蛋白杀线虫活性最高。上清液天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分离杀虫蛋白结果显示6条清晰蛋白带,其中37kDa蛋白含量最多。

苏云金杆菌SD-5菌株发酵生理学研究及生产

通过苏云金杆菌ＳＤ－５菌株对混合氨基酸的抗性及在３吨发酵罐中发酵生理学的研究，显示ＳＤ－５菌株具有优良的发酵性能。用正交试验设计方法筛选出 ＳＤ－５菌株发酵培养基配方，菌数可达 １１０－１３０亿／ｍｌ．芽孢率达９５％以上。

HW236-5发酵产品——纳豆激酶的酶学特性研究

本次试验所用纳豆激酶是由本所分离并命名的HW236-5纳豆芽孢杆菌,发酵大豆经提取分离获得,主要对纳豆激酶的酶学特性进行研究。采用SDS-PAGE法以及Zeta电位法分别测得纳豆激酶的分子量为28kDa,等电点为8.58,纳豆激酶的酶活为62520U/g。纳豆激酶在不同的加热温度时,温度越高,其酶活越低。NaCl在浓度低于1.35mol/L时,对纳豆激酶的酶活起到促进作用,但是高于此浓度时,纳豆激酶的酶活明显受到了抑制。

SD－5菌株原生质体形成与再生条件的研究

探讨了培养基成分、培养时间、高渗缓冲液成分和ｐＨ、溶菌酶浓度以及酶解温度和时间对苏云金杆菌ＳＤ—５菌株原生质体形成和再生的影响；结果表明，ＳＤ—５菌株原生质体形成和再生的最佳条件组合为：ＰＢＧ培养基、３０℃培养１４ｈ再活化５ｈ，以ＳＭＭｐＨ６．５作酶解缓冲液，溶菌酶浓度０．６ｍｇ／ｍｌ，３４℃处理６０ｍｉｎ．

Cry1Ac敏感和抗性小菜蛾bre-3和bre-5基因mRNA的表达差异研究

在室内选用Cry1Ac对小菜蛾Plutella xylostella 3龄幼虫进行抗性选育,获得相对抗性为356倍的抗性种群DBM1Ac-R品系。应用实时定量基因扩增荧光检测(real time quantitative PCR,real-time qPCR)技术检测敏感小菜蛾DBM1Ac-S和抗性小菜蛾DBM1Ac-R品系鞘糖脂(Glycosphingolipids,GSLs)合成酶基因bre-3和bre-5 mRNA在2龄、3龄、4龄和老熟幼虫、蛹及4龄中肠的表达情况。结果显示:bre-3和bre-5在两个品系的5个时期和4龄中肠均有表达,其中DBM1Ac-S品系的bre-3 mRNA在3龄、4龄和老熟幼虫的相对表达量显著高于DBM1Ac-R品系(P<0.05),分别为DBM1Ac-R品系的2.36、5.54和2.68倍;DBM1Ac-S品系的bre-5 mRNA在2龄至蛹期的相对表达量分别为DBM1Ac-R品系的1.19、3.13、1.78、1.75和1.65倍,其中由3龄到蛹期差异显著(P<0.05)。DBM1Ac-R品系3龄至老熟幼虫的bre-3和bre-5 mRNA相对表达量降低可能与小菜蛾长期的Cry1Ac汰选有一定的关系。比较同一种群、同一龄期(包括4龄中肠)的bre-3和bre-5 mRNA相对表达量差异时,发现bre-5相对表达量均高于bre-3。研究结果为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白受体之一GSLs的进一步研究提供了一定的基础。

阿氏芽孢杆菌解硅微生物菌剂MB35-5对日光温室黄瓜土壤有效硅含量及产量的影响

为了明确新型解硅菌剂阿氏芽孢杆菌解硅微生物菌剂MB35-5在日光温室黄瓜中的应用效果,并为新型生物解硅菌剂在实际生产中应用提供理论依据,通过大田试验与室内分析相结合的方法,研究了阿氏芽孢杆菌解硅微生物菌剂MB35-5对日光温室黄瓜土壤有效硅含量以及黄瓜生长、产量和抗病性的影响。结果表明:在不施用外源硅的条件下,施用微生物菌剂MB35-5能够有效补充黄瓜生长消耗的土壤有效硅,施用量为3 000和6 000 g/hm^(2)处理黄瓜收获后的土壤有效硅含量分别较播前增加了13.8%和16.1%,分别较CK增加了24.6%和27.2%;能够显著促进黄瓜植株生长,有效增强抗病性,明显提高黄瓜产量,施用量为3 000和6 000 g/hm^(2)处理的产量分别较CK增加8.8%和11.9%。施用量6 000 g/hm^(2)处理在补充土壤有效硅、提高黄瓜产量、增强黄瓜抗病性方面的效果优于施用量3 000 g/hm^(2)处理,在实际生产中建议MB35-5的施用量为6 000 g/hm^(2)。

苏云金杆菌SD－5菌株晶体蛋白的研究

研究了ＳＤ－５菌株伴孢晶体结构多肽组成和抗原特性，分析了氨基酸组成并进行了糖蛋白的检测．结果表明：ＳＤ－５晶体蛋白主含Ｍｗ１３５０００、Ｍｗ６５０００两条多肽，另见有－Ｍｗ２４００００的弱带，不同方法处理的样品，电泳图谱有一定差异；ＳＤ－５晶体蛋白抗血清与其晶体抗原形成两条沉淀线，而与７２１６、ＨＤ－１形成一条沉淀线；ＳＤ－５晶体蛋白由１８种氨基酸组成，不含糖蛋白成分．

含组氨酸标签的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶的高效表达

以枯草杆菌基因组为模板,通过PCR扩增枯草杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶基因hemB。将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28 a中构建成表达载体。表达蛋白的N端含有6个组氨酸标签。构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,重组蛋白获得高效表达。SDS-PAGE检测到41 kD的特异带,表达菌株的上清检测到ALAD的比活为337 mU.mg-1,表明组氨酸标签不显著影响酶活。

枯草芽孢杆菌二步发酵法生产5’-肌苷酸

5’-肌苷酸作为新一代增味剂的重要组成成分,在调味品行业具有十分重要的地位。为进一步缩短5’-肌苷酸生产周期,降低生产成本,在研究来源于摩氏摩根菌Morganella morganii的酸性磷酸酶AP/PTaseM催化条件基础上,将该酶编码基因pho CYM克隆至肌苷生产菌株Bacillus subtilis JG,获得B.subtilis JAB和B.subtilis JAF,并根据重组菌株合成肌苷及表达酸性磷酸酶的特性,通过调控发酵条件实现了肌苷发酵和酶催化相偶联的二步发酵法生产5’-肌苷酸。经摇瓶发酵实验验证,两菌株5’-肌苷酸产量分别为2.4 g/L和3.0 g/L。

地衣芽孢杆菌BL-5芽孢生成条件优化

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)作为微生态制剂在食品或饲料工业中具有广泛的应用前景。通过温度对地衣芽孢杆菌BL-5致死率的影响研究得出无芽孢菌体的致死温度为75℃。以芽孢率和芽孢数为评价指标,得到地衣芽孢杆菌BL-5芽孢生成的最佳培养基配方为:蔗糖29.85 g/L、硫酸铵10.00 g/L、酵母膏3.00 g/L、磷酸氢二钾3.42 g/L、硫酸镁1.5 g/L、pH 8.0。最佳培养条件为:接种量5%、发酵时间48 h,发酵温度30℃、转速150 r/min。

改性ZSM-5分子筛负载微生物去除废水中Pb^(2+)的研究

实验首先对ZSM-5分子筛(MS)进行碱改性,然后在经碱改性的ZSM-5分子筛(A-MS)上负载巨大芽孢杆菌,制备得到碱改性ZSM-5分子筛负载微生物(A-MS-BM)吸附剂,最后分别对MS、A-MS及A-MS-BM对含Pb^(2+)重金属离子废水进行吸附去除实验研究。结果表明:当Pb^(2+)初始浓度为20 mg/L,吸附剂用量为1.0 g/L时,MS和AMS对Pb^(2+)的去除率分别为84.35%和94.60%,A-MS较MS来说吸附平衡时间缩短至30 min,具有较高的吸附效率。利用A-MS-BM对Pb^(2+)进行吸附实验,与A-MS吸附剂相比,A-MS-BM对Pb^(2+)的去除率提高到99.80%。说明制备的A-MS-BM对Pb^(2+)具有很好的吸附效率,扩大了分子筛和微生物在水处理技术方面的应用范畴,为重金属废水的处理提供一种新的思路。