密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。

弓形虫MIC1蛋白在杆状病毒系统中的表达及活性分析

为构建可溶性表达弓形虫MIC1蛋白质的重组杆状病毒株并分析重组蛋白质的活性,通过PCR扩增弓形虫mic1基因的编码序列并连接到pFastBac 1质粒中,将重组的转移质粒转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒,转染Sf9细胞后连续培养3代获得重组杆状病毒株。结果显示,Sf9细胞在感染后的第3天出现典型的细胞病变;间接免疫荧光和Western blot试验结果表明MIC1重组蛋白质在感染的Sf9细胞中成功可溶性表达;纯化的MIC1重组蛋白质不仅具有结合唾液酸乳糖的能力,同时能够刺激Balb/c小鼠产生较高水平的特异性抗体(>1∶25600)。以上结果表明,通过杆状病毒表达系统可获得具有生物学活性的弓形虫MIC1重组蛋白质。

昆虫杆状病毒表达的猪圆环病毒2d型Cap蛋白-VLP对仔猪的免疫保护效果

猪圆环病毒2d基因型(Porcine circovirus type 2d,PCV2d)为猪场当前流行的PCV2优势基因型,为了研究针对PCV2d基因型的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗,提高猪圆环病毒病的防控效果。本研究利用杆状病毒表达系统表达了能够自组装为VLP的PCV2d-Cap蛋白,然后将9头21日龄健康仔猪随机分为VLP组、攻毒对照组和空白对照组(n=3)。VLP组的每头仔猪经颈部肌肉注射400μg Cap蛋白-佐剂复合物(PCV2d-VLP),攻毒组注射等体积的PBS与佐剂混合物,空白组注射等体积的PBS。共接种2次,每次间隔14 d。于第2次免疫后21 d,VLP组和攻毒对照组的仔猪通过鼻腔感染PCV2 HBDX-2018株(106TCID50/头),评价PCV2d-VLP诱导的免疫效果。结果表明PCV2d-VLP能够诱导仔猪产生高水平的特异性IgG抗体和中和抗体,刺激IFN-γ水平升高,引起外周血淋巴细胞增殖能力增强,降低病毒经鼻腔和直肠的排毒率及病毒血症阳性率,减轻腹股沟淋巴结和脾脏的病理损伤,降低组织中的病毒载量。上述研究表明,应用杆状病毒表达的PCV2d-Cap蛋白能自组装为VLP,并能诱导仔猪产生良好的免疫保护效应,具有进一步开发为PCV2d-VLP疫苗的潜力。

牛冠状病毒S1蛋白的真核表达及间接ELISA方法的建立与应用

为建立一种检测牛冠状病毒(BCoV)的抗体间接ELISA检测方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达BCoV的S1蛋白,并作为包被抗原,建立BCoV的S1蛋白抗体间接ELISA检测方法,应用于临床样品检测。结果显示,S1蛋白大小约100 ku,可表达于昆虫High5细胞培养基上清,经Western blot鉴定S1蛋白抗原性良好;经反应条件优化,确定抗原包被浓度为0.125μg·mL^(-1),血清稀释度为1∶200;采用1%明胶,于37℃封闭3 h;血清样品于37℃孵育30 min;酶标二抗的稀释度1∶25000,37℃孵育45 min;37℃避光显色13 min;临界值为0.297;经检验,该方法特异性良好;批间及批内变异系数均小于10%。当临界值为OD_(450 nm)为0.297时,若以IFA为标准,ELISA的敏感性为96.88%(31/32),特异性为87.50%(7/8),与IFA具有很强的一致性(κ=0.844,P<0.01);若以中和试验为标准,ELISA的敏感性为100.00%(31/31),特异性为88.89%(8/9),与血清中和试验具有很强的一致性(κ=0.925,P<0.01)。采用该方法对303份牛血清进行检测,BCoV阳性率为74.91%。由此说明,本研究建立的ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于BCoV的血清学调查和临床诊断,并可以应用于替代中和试验检测BCoV免疫后抗体水平。

杆状病毒表达系统表达BCoV纤突蛋白及其对小鼠的免疫原性

旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH10Bac同源重组后转染昆虫细胞收获重组杆状病毒rpFastBac-S,利用基因组PCR、免疫印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验对其进行鉴定,测定杆状病毒滴度。优化和筛选感染剂量对蛋白表达的影响,超速离心纯化蛋白,免疫小鼠和评估其免疫效果。结果显示:优化后全长4108 bp的BCoV S基因CAI(密码子适应指数)从0.39调整为0.87,平均GC含量从35.8%调整为50.6%。经双酶切、PCR验证,重组质粒与重组杆粒均构建成功。用5μg重组杆粒Bacmid-S转染Sf9细胞并传代至第四代后细胞病变趋于稳定,感染杆状病毒约20 h后产生典型病变,收获重组杆状病毒进行鉴定。PCR电泳结果显示重组杆粒携带S目的蛋白基因;间接免疫荧光试验显示,试验组观察到特异性绿色荧光;Western blot结果显示重组杆状病毒rpFastBac-S所表达的蛋白为S目的蛋白,目的条带位于250 ku左右,感染剂量MOI=0.5时蛋白表达量最高。将50μg蛋白、20μg CpG免疫增强剂与等体积MF59佐剂充分混合乳化后,肌肉注射免疫小鼠,间接ELISA试验结果显示,小鼠免疫蛋白后产生了IgG特异性抗体,且抗体水平高于佐剂对照组(P<0.001),最高抗体效价达1∶12800;微量中和试验结果显示,小鼠血清中和效价最高达1∶224,试验组中和效价平均值高于灭活病毒组,但统计学差异不显著(P>0.05)。本研究利用杆状病毒表达系统表达了牛冠状病毒S蛋白,并对S蛋白免疫保护效果做了进一步评价,为后续牛冠状病毒疫苗研究提供了理论依据。

鳜弹状病毒糖蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

近年来,鳜弹状病毒引起的病害频发,该病毒传播快,致病性强,是引起鳜病害的主要病原之一。鳜弹状病毒基因组编码5个结构蛋白,其中糖蛋白G是病毒表面的主要抗原,为实现该抗原蛋白的大量表达,利用分子克隆技术将鳜弹状病毒糖蛋白G片段插入杆状病毒穿梭载体pFastBac1中转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后,筛选阳性克隆获得重组转移载体pFastBac-G,再将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑与抗性筛选后获取重组杆粒rBacmid-G,随后利用脂质体转染法将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒。将获取到的P3代重组病毒感染Sf9昆虫细胞进行重组蛋白的SDS-PAGE检测,成功表达后利用镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白,随后对重组蛋白进行Western blot鉴定,结果显示在大于50 ku处有一条特异性条带,而对照组无条带,表明制备的抗原能与抗体特异性结合。结果表明,鳜弹状病毒糖蛋白G在杆状病毒表达系统成功表达。本试验结果可为鳜弹状病毒糖蛋白G疫苗的研发和大规模生产提供技术支撑。

QX型传染性支气管炎病毒病毒样颗粒的制备与初步评价

研究旨在制备一种针对QX型传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗并对其免疫保护效果进行初步评价。试验首先构建了分别表达QX型IBV S蛋白(QXLS)、M蛋白(QXLM)和E蛋白(QXLE)的三种重组杆状病毒rBacmid-QXLS、rBacmid-QXLM和rBacmid-QXLE,并通过间接免疫荧光试验(IFA)和West-ern blot鉴定目的蛋白的表达;进一步将3种重组杆状病毒通过适当比例共感染Sf9细胞获得VLP,经蔗糖密度梯度离心纯化后使用透射电子显微镜观察鉴定VLP的组装效果;最后将纯化的VLP与氢氧化铝佐剂混合制成疫苗免疫SPF鸡进行免疫保护效果评价。结果显示:S、M和E三种目的蛋白均能成功表达,透射电子显微镜观察可见组装形成的VLP呈现典型的椭圆形病毒样结构,直径为80~120 nm;单独VLP疫苗免疫具有一定的免疫保护效果,QXL87+VLP疫苗联合免疫保护效果较好,可有效减轻临床病变、降低气管和泄殖腔排毒量及组织器官载毒量。研究表明,试验已经成功制备出QX型IBV VLP,且具有良好的免疫原性,为后续进一步研制基于VLP技术的QX型IBV基因工程疫苗奠定了基础。

蓝舌病病毒VP7抗原在重组杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

本试验通过在重组杆状病毒表达系统中制备、纯化与鉴定蓝舌病病毒VP7抗原,为开发蓝舌病病毒免疫学抗体检测方法提供科学依据。利用SignalP与TMHMM在线软件分析VP7序列的信号肽与跨膜疏水区序列,对选择的目的基因片段进行稀有密码子优化,将化学合成后的核苷酸序列连接至pFastBacHTA载体上,并构建相应的重组杆粒Bacmid-VP7-DH10Bac,转染sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒Bacmid-BTV-VP7株,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达制备蓝舌病病毒VP7抗原。结果显示,重组杆粒Bacmid-VP7-DH10Bac转染sf9昆虫细胞并连续盲传5代后,成功获得重组杆状病毒Bacmid-BTV-VP7株,并成功表达纯化出VP7蛋白,大小约为43 kDa,蛋白纯度约为94%;VP7重组蛋白与其他疫病抗体无非特异性交叉。综上,重组VP7蛋白能够与BTV阳性血清呈现特异性反应,具有良好的反应原性,蛋白纯度高,并且具有病毒蛋白的生物学活性,将其作为诊断抗原,后期可用于开发系列免疫学抗体诊断检测技术。

牛IFN-γ真核表达系统的构建及单克隆抗体的制备与鉴定

为构建牛γ干扰素(IFN-γ)真核表达系统并制备单克隆抗体,将IFN-γ的基因克隆至pFastBacl载体上,构建pFastBacl-IFN-γ重组质粒,转化到DH10Bac后形成重组Bacmid,经过蓝白斑筛选将重组杆粒转染到Sf9细胞,经鉴定,获得了表达IFN-γ的重组杆状病毒;通过感染处于对数生长期的Sf9细胞,纯化细胞培养液上清获得了真核表达的牛IFN-γ蛋白。用纯化的IFN-γ蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得4株能稳定分泌的抗牛IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经双抗夹心ELISA方法检测,结果显示4C3和4H11具有较好的夹心效果,为后续牛结核病IFN-γ体外释放ELISA检测试剂盒的研发奠定了基础。

昆虫杆状病毒多角体蛋白基因超高水平表达的分子机制研究进展

昆虫杆状病毒的生活史中令人惊奇的现象之一是其极晚期基因多角体蛋白(polyhedrin,polh)基因的超高水平表达,表达产生的多角体蛋白将病毒粒子包埋到内部形成包涵体。本文根据已有的研究结果,从3个方面概括了polh基因超高水平表达的机制,即polh启动子的结构特征和转录调控、polh mRNA的结构和翻译调控以及影响polh基因表达的蛋白调控因子,期望有助于更好地理解polh超高水平表达调控的分子机制,为提高杆状病毒表达载体系统表达外源蛋白效率提供理论指导。

狂犬病颗粒样疫苗的制备及免疫评价

为研发高免疫原性的新型狂犬病颗粒样疫苗,利用PCR方法扩增狂犬病病毒HEP-Flury株的G蛋白和M蛋白基因序列,将其依次克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统穿梭载体pFastBac dual上,构建重组质粒pFD-GM。制备基于pFD-GM的重组杆粒,转染至Sf9细胞,得到重组杆状病毒rb-GM,在Sf-9细胞中表达获得病毒样颗粒VLP-GM。经SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光鉴定,重组杆状病毒成功表达了G蛋白(约56 kDa)和M蛋白(约23 kDa);经电镜观察,VLP-GM大小约为100 nm×50 nm,呈表面带有纤突的子弹形状,与典型的狂犬病病毒粒子类似。将VLP-GM免疫犬,经测定犬在二次免疫后产生较灭活疫苗更高的中和抗体水平,达到7.81 U/mL,并且与单独免疫G蛋白相比可刺激更多细胞因子如白细胞介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)生成。本研究成功表达了狂犬病病毒的病毒样颗粒VLP-GM,证明了其免疫原性,为后续的疫苗研制和抗体制备奠定了基础。

Sequence and Molecular Evolution Analysis of Ubiquitin Proteins Encoded by Baculoviruses

[Objective] The aim of this study was to analyze the sequence characteristics and molecular evolution of ubiquitins encoded by baculoviruses.[Methods]Clustal W software was used for multiple sequence alignment analysis,and neighbor-joining method（NJ）and maximum parsimony method（MP）were used for the construction of phylogenetic tree.[Results]The baculoviral ubiquitins showed 73%-86% sequence identity to eukaryotic ubiquitin.Two heterogeneous regions of baculoviral ubiquitins were observed：one was the residues from 15-32,the other was located from residues 53 to 60.The else parts were conserved,where many functional amino acids were also observed.Phylogenetic analysis indicated that baculoviral ubiquitins could be divided into three sub-families,including sub-family GV,sub-family I and sub-family II.The molecular evolution of baculoviral ubiquitins might be under negative selection to maintain their functional and structural stability.[Conclusion]The analysis had provided reference for the researches on functional characterization of baculoviral ubiquitins.

表达驱动蛋白KIF4A磷酸化突变体蛋白重组杆状病毒的构建

目的:探究驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)在细胞有丝分裂早期调控染色质凝缩的作用机制。方法:本研究构建表达KIF4A磷酸化突变体蛋白的重组质粒,转化DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选后提取重组杆状病毒基因组,转染Sf9细胞并培养以获得病毒液。结果:通过昆虫杆状病毒表达系统成功获得表达KIF4A突变体蛋白的病毒液。结论:本研究为后续大量表达及体外纯化KIF4A突变体蛋白奠定了实验基础。

ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。

表达鸡RSAD2蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

为研究鸡S-腺苷甲硫氨酸基区域蛋白2(RSAD2)生物学功能,试验构建原核表达重组质粒pGEX-RSAD2,采用SDS-PAGE、Western blot验证RSAD2融合蛋白的表达,将融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。扩增RSAD2基因克隆至pFsatBac dual真核表达载体,重组质粒经转座、蓝白斑筛选后,获得重组杆状病毒质粒pFastBac-RSAD2,重组杆粒转染至sf9昆虫细胞后收获重组杆状病毒rBac-RSAD2。用鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染孵育RSAD2蛋白的MDCC-MSB1细胞,通过荧光定量PCR检测病毒在细胞中的增殖情况。结果显示:成功构建原核表达质粒pGEX-RSAD2,诱导表达了69 ku的RSAD2融合蛋白,制备的多克隆抗体能够与表达RSAD2蛋白的DF-1细胞特异性结合;重组杆状病毒rBac-RSAD2能够引起sf9细胞病变,且感染后的sf9细胞与制备的RSAD2多克隆抗体能够特异性结合,rBac-RSAD2表达了43 ku的RSAD2蛋白;相较对照组,孵育蛋白后的MDCC-MSB1细胞中的病毒载量降低。研究表明,成功构建了表达鸡RSAD2蛋白的重组杆状病毒rBac-RSAD2,其表达的RSAD2蛋白能够抑制CIAV增殖。

基因缺失杆状病毒载体的构建及应用

为解决杆状病毒表达系统存在的表达量低和毒种种子批代次窄问题,加快杆状病毒表达系统产业化进程。本研究首次通过Red和Cas9两种重组技术,先后对影响蛋白表达的V-cath、ChiA、P10和重组杆状病毒基因组稳定性的FP25K和DA26基因进行缺失。同时基于对CSFV-E2蛋白的结构和糖基化预测分析,突变影响同源二聚体二硫键形成的糖基化位点。最后通过悬浮转染的方式提高拯救病毒的滴度。结果表明对E2基因突变后,表达的E2蛋白95%以同源二聚体形式存在。通过供体质粒优化和病毒载体基因缺失,E2蛋白的表达水平提高约4倍,可稳定表达蛋白的重组杆状病毒毒株代次从P7代延长至P20代。悬浮转染获得的重组杆状病毒滴度提高约70倍,同时获得足量低代次的毒种,有效缩短从毒种构建到蛋白表达时间,有效解决杆状病毒表达系统表达量低和毒种种子批代次窄的问题,为猪瘟亚单位疫苗研发奠定基础。

H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。

杆状病毒表达系统中NLS序列对鸭圆环病毒Cap基因表达的影响及其免疫原性研究

为了研究核定位信号肽(Nuclear localization signal,NLS)序列对鸭圆环病毒(duck Circovirus,DuCV)Cap蛋白表达的影响,并探究不同免疫策略下重组蛋白的免疫原性,试验将去除和未去除NLS序列的DuCV Cap基因分别克隆至杆状病毒载体pFastBacⅠ中,通过杆状病毒表达系统进行表达,分析NLS序列对Cap蛋白表达的影响。采用不同的免疫策略,分别以原核表达系统构建的重组蛋白rCap(rCap组)、杆状病毒表达系统构建的rvAc-Cap(rvAc-Cap组)及rCap与rvAc-Cap联合(Prime-Boost组)作为免疫源免疫Balb/c小鼠,并设置PBS对照组,定期采血,检测DuCV IgG抗体水平、淋巴细胞增殖指数(SI)和γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)等细胞因子水平,评价其免疫效果。结果表明:利用杆状病毒表达系统成功表达出重组杆状病毒rvAc-Cap和rvAc-NLS-Cap,且去除NLS序列的Cap基因表达水平更高;小鼠免疫重组蛋白rCap后,重组蛋白rCap与重组杆状病毒rvAc-Cap均能够刺激小鼠产生特异性IgG抗体,三免后Prime-Boost组的IgG抗体水平最高,而与其他免疫组差异不显著(P>0.05);三免后各免疫组淋巴细胞增殖指数显著高于PBS对照组,差异显著(P<0.05);各免疫组IFN-γ、IL-2和IL-4水平与PBS对照组比较差异显著(P<0.05),且Prime-Boost组水平最高。说明在杆状病毒表达系统中去除NLS序列可以提高Cap基因的表达;重组杆状病毒rvAc-Cap能够活化小鼠的免疫系统,刺激小鼠机体产生体液免疫与细胞免疫,而Prime-Boost免疫策略有效提高了免疫效果。

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究

为建立一套表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺,提高反应器上猪瘟病毒E2蛋白的表达量,以商业化培养基为基础,通过对关键营养组分添加量的DOE试验设计优化,获得一种组合补料配方,并在3 L反应器上对补料方式进行优化,以最大限度提高细胞密度。进一步在反应器上摸索了通气策略,以精确调控猪瘟E2重组杆状病毒培养过程的营养代谢平衡,解决副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活力下降的问题。首次使用半连续补料工艺与渗透压动态平衡相结合的补料策略以及定向调节通气的工艺模式,使猪瘟病毒E2蛋白的表达量由130 mg/L增加至520 mg/L,提高了3倍。将3 L反应器工艺在100 L反应器上进行了连续3个批次的验证,结果猪瘟病毒E2蛋白的表达量均大于500 mg/L,收获猪瘟E2蛋白制备的疫苗抗体均在2周后转阳,且抗体水平持续上升,接种后8周抗体阻断率仍维持在80%左右。综上,3 L反应器工艺能够稳定放大至100 L反应器,建立了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒100 L反应器工艺,且100 L反应器上重组蛋白的表达量稳定、免疫原性良好。

基于非洲猪瘟病毒MGF505-3R蛋白的间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的间接ELISA检测方法,试验基于ASFV MGF505-3R基因序列,构建pET-28a(+)-3R原核表达系统和pFastBac1-3R杆状病毒表达系统,分别通过37℃诱导5 h和28℃培养5 d获得3R重组蛋白,以此为包被抗原建立快速检测ASFV的间接ELISA检测方法,对该检测方法的反应条件、阴阳性临界值、敏感性、特异性及重复性进行检测,并用该检测方法与ASFV抗体ELISA检测试剂盒对70份临床血清样品进行符合率验证试验。结果表明:原核表达系统与杆状病毒表达系统表达的3R重组蛋白抗原特异性均良好。利用杆状病毒表达系统表达的3R重组蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法的最佳条件为:包被浓度为2μg/mL,血清稀释度为1∶80,5%BSA 37℃封闭2 h,ASFV阳性血清(一抗)37℃孵育90 min,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG(二抗)37℃孵育45 min。该间接ELISA检测方法的批间和批内变异系数均小于10%;与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等常见病原阳性血清无交叉反应;该检测方法的临界值为0.38,ASFV阳性血清稀释至640倍检测仍高于临界值。该检测方法与ASFV抗体ELISA检测试剂盒的阳性符合率、阴性符合率、整体符合率分别为92%(37/40)、86%(26/30)、90%(63/70)。说明试验基于3R重组蛋白建立的间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性与重复性,可以用于临床血清样品中ASFV抗体的检测。