Functional characterization of triterpene synthases in Cibotium barometz

Cibotium barometz(Linn.)J.Sm.,a tree fern in the Dicksoniaceae family,is an economically important industrial exported plant in China and widely used in Traditional Chinese Medicine.C.barometz produces a range of bioactive triterpenes and their metabolites.However,the biosynthetic pathway of triterpenes in C.barometz remains unknown.To clarify the origin of diverse triterpenes in C.barometz,we conducted de novo transcriptome sequencing and analysis of C.barometz rhizomes and leaves to identify the candidate genes involved in C.barometz triterpene biosynthesis.Three C.barometz triterpene synthases(CbTSs)candidate genes were obtained.All of them were highly expressed in C.barometz rhizomes,consisting of the accumulation pattern of triterpenes in C.barometz.To characterize the function of these CbTSs,we constructed a squalene-and oxidosqualene-overproducing yeast chassis by overexpressing all the enzymes in the MVA pathway under the control of GAL-regulated promoter and disrupted the GAL80 gene in Saccharomyces cerevisiae simultaneously.Heterologous expressing CbTS1,CbTS2,and CbTS3 in engineering yeast strain produced cycloartenol,dammaradiene,and diploptene,respectively.Phylogenetic analysis revealed that CbTS1 belongs to oxidosqualene cyclase,while CbTS2 and CbTS3 belong to squalene cyclase.These results decipher enzymatic mechanisms underlying the origin of diverse triterpene in C.barometz.

补骨脂-淫羊藿对类风湿关节炎抗炎机制的分子对接分析:动物实验验证

背景:临床上补骨脂-淫羊藿治疗类风湿关节炎疗效明显,但两者所含有效成分复杂,在分子水平上治疗类风湿关节炎的作用机制仍不明确。目的:基于网络药理学和分子对接技术建立胶原诱导型关节炎模型,验证补骨脂-淫羊藿治疗类风湿关节炎可能的作用靶点及通路,为以补骨脂-淫羊藿为主的临床方剂使用提供可靠的实验依据。方法:借助中医药研究平台、中医百科全书和上海有机所的中药与化学成分数据库等检索并筛选有效成分,从PubChem平台获取3D分子式,通过PharmMapper和SwissTargetPrediction平台进行靶标预测;结合DrugBank、GeneCards、OMIM等基因数据库完成类风湿关节炎的疾病靶点获取,经Uniport数据库校准靶标,借助VENNY 2.1获取补骨脂-淫羊藿与疾病交集靶点并绘制韦恩图;采用STRING平台构建蛋白质互作网络图;使用Metascape平台进行基因本体论功能分析及京都基因与基因组百科全书分析,进行数据可视化,利用Cytoscape 3.9.0构建中药-成分-靶点-疾病-通路四重网络模型;运用AutoDock-Vina软件将主要有效成分与核心靶点进行分子对接验证,探索最佳结合靶点。建立Ⅱ型胶原+佐剂诱导型关节大鼠模型,用补骨脂-淫羊藿干预21 d后,观察其对相关通路靶点及炎性细胞因子的影响。结果与结论:①筛选补骨脂与淫羊藿活性成分28个,与类风湿关节炎交集靶点共288个,主要成分有异补骨脂素、补骨脂定、淫羊藿苷等;交集靶点主要有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子A等;②基因本体论分析获得生物过程2232条,主要与丝氨酸蛋白磷酸化、AKT正调控、活性氧代谢过程等功能有关;③京都基因与基因组百科全书富集分析结果202条,主要有PI3K/AKT信号通路和表皮生长因子受体信号通路等,可能通过调节滑膜细胞凋亡与增殖、抑制炎性因子等发挥治疗作用;④分子对接结果表明补骨脂-淫羊藿主要与AKT1及雌激素受体转录因子1结合活性最强,并形成稳定结构,与PI3K/AKT等凋亡增殖、炎性介导等调控信号通路密切相关;⑤补骨脂-淫羊藿可降低胶原诱导型关节炎大鼠模型血清中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α的表达;⑥补骨脂-淫羊藿可调低胶原诱导型关节炎大鼠模型关节滑膜中p-PI3K、p-AKT、p-FOXO1蛋白的表达;⑦结果证明,补骨脂-淫羊藿可能经PI3K/AKT/FOXO1信号通路抑制关节滑膜细胞增殖和抑制炎性因子表达等发挥治疗作用,这可能与类风湿关节炎关节炎症和骨破坏的发生密切相关,同时为临床的合理使用及新药开发提供了参考依据。

狗脊多糖调控lncRNA NEAT1延缓椎间盘终板软骨细胞衰老的作用研究

目的:探讨狗脊多糖通过调节lncRNA NEAT1延缓椎间盘终板软骨细胞衰老的作用机制。方法:将15只C57BL/6小鼠的椎间盘终板软骨细胞进行体外培养;经10 ng·mL-1白细胞介素-1β(IL-1β)干预24 h诱导软骨细胞;将软骨细胞随机分为空白对照组、模型对照组(10 ng·mL-1IL-1β)和狗脊多糖各剂量组(100,200,400μg·mL-1);Real-time PCR及Western blot分别检测狗脊多糖对IL-1β诱导软骨细胞lncRNA NEAT1、衰老相关通路p53-p21中p53、p21水平及衰老相关分泌表型的基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白表达情况;流式细胞术检测各组软骨细胞凋亡率情况。结果:Real-time PCR结果显示,经IL-1β诱导的椎间盘终板软骨细胞中lncRNA NEAT1、p21、p53水平显著增高;与模型对照组比较,狗脊多糖各剂量组lncRNA NEAT1、p21、p53水平显著降低;与空白对照组比较,经IL-1β诱导的椎间盘终板软骨细胞中MMP-13、Caspase-3蛋白表达含量显著增高,CollagenⅡ蛋白表达降低;经狗脊多糖干预后,可显著改善MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白表达;此外,与模型对照组比较,狗脊多糖各剂量组椎间盘终板软骨细胞凋亡率呈现下降趋势。结论:狗脊多糖通过调控lncRNA NEAT1影响p53、p21、MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3表达,降低软骨细胞凋亡率,进而延缓椎间盘终板软骨细胞衰老。

常见伴生植物对药用植物金毛狗Cibotium barometz孢子萌发和配体子体发育的化感作用研究

目的:通过伴生种镰羽复叶耳蕨Arachniodes falcate和山姜Alpinia japonica水浸出液对金毛狗孢子萌发和配子体发育作用的研究,弄清伴生种与金毛狗的化感作用。方法:将金毛狗成熟孢子分别接种在含有不同浓度的2种伴生植物浸出液的MS培养基上,利用显微技术,观察记录孢子萌发和配子体发育过程。结果:金毛狗孢子萌发延迟,假根伸长受抑制;对原叶体形成和性别分化均具有明显的延迟和抑制作用,浓度越高抑制作用越明显。结论:2种伴生植物对金毛狗孢子萌发和配子体发育化感作用显著,这可能对金毛狗孢子体产生以及种群壮大具有较大的影响。

金毛狗的研究进展

金毛狗Cibotium barometz(L.)J.Sm.为桫椤目蚌壳蕨科植物,其根茎称为金毛狗脊。金毛狗含有挥发油类、蕨素类、酚酸类、黄酮类、多糖类、萜类及微量元素等化学成分,具有较高的观赏、药用和食用价值。近年来,金毛狗的野生资源不断减少,现已被列入国家二级保护植物。对金毛狗的资源状况、生物学特性、种苗繁育技术、化学成分和药用价值等方面进行综述,以期为其种苗繁育、野生资源的可持续发展、科学保护和合理的开发利用提供参考。

金毛狗脊原叶体增殖和孢子体转化条件的优化

为探究不同浓度的无机盐、蔗糖、KT、NAA和6-BA等对金毛狗脊原叶体增殖和孢子体转化的影响,采用正交设计实验方法,设置5因素4水平正交试验,筛选金毛狗脊原叶体增殖和孢子体转化的最佳培养基。结果表明,原叶体增殖最佳培养基为1/2MS+2%蔗糖+0.1 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。孢子体转化最佳培养基为1/4MS+1%蔗糖+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA。

金毛狗脊的化学成分研究

通过对金毛狗脊[Cibotium barometz(L.) J.Sm.]根茎乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分进行分离纯化,得到8个化合物。经物理方法和谱学分析,分别鉴定为(24R)-豆甾-4-烯-3-酮(1),24-亚甲基环木菠萝烷醇(2),β-谷甾醇(3),(3R)-去-O-甲基毛狄泼老素(4),原儿茶醛(5),金粉蕨亭(6),交链孢霉酚(7)和胡萝卜苷(8)。化合物1、2、4和7为首次从该属植物中分离得到。

狗脊升华物中5-羟甲基糠醛分析

目的 :研究狗脊炮制后的刺激性成分。方法 :用升华法制备样品 ,用薄层层析法分离 ,用光谱法鉴定。结果 :首次从狗脊升华物中分离鉴定了 5 羟甲基糠醛 ,并证明了是由果糖或葡萄糖脱水转化而成 ,同时证明砂烫品中也含有此成分。结论 :5 羟甲基糠醛有一定的刺激性 ,但不是狗脊炮制品唯一的刺激性成分 。

狗脊炮制品中促进成骨细胞增殖分化成分的筛选

目的筛选狗脊炮制品正丁醇萃取物中促进成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性的组分;探索狗脊抗骨质疏松的机理及具体有效组分。方法将狗脊炮制品正丁醇萃取物的三氯甲烷-甲醇洗脱部分与成骨细胞共同培养,以MTT法检测细胞的增殖,用碱性磷酸酶试剂盒测定培养液中AKP酶活性。结果通过各组分与细胞共同培养,其中极性偏大的组分对细胞增殖作用较强,尤以三氯甲烷-甲醇3∶1组和3∶1-D组作用最强,且促进AKP活性也最强。结论能够显著促进成骨细胞增殖及AKP酶活性的有效成分可能存在于极性较大的3∶1-D组中,并且推测可能通过促进成骨细胞增殖及分化的机理来发挥抗骨质疏松作用。

狗脊不同炮制品的抗炎作用及其机制研究

目的研究狗脊不同炮制品的抗炎作用及其机制。方法以脂多糖(LPS)刺激单核巨噬细胞RAW264.7为体外模型,通过比较细胞上清液中炎性细胞因子白介素-1(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)以及炎性介质一氧化氮(NO)和前列腺素(PGE2)的水平和总评分,评价狗脊不同炮制品的抗炎作用。结果与空白组相比,生狗脊、烫狗脊、酒狗脊、盐狗脊、蒸狗脊对各细胞因子和炎性介质均有一定影响,综合评分由高到低,依次为生狗脊>烫狗脊>酒狗脊>盐狗脊>蒸狗脊。结论生狗脊和烫狗脊的抗炎效果较好,而酒狗脊、盐狗脊、蒸狗脊的作用次之。

狗脊不同炮制品中鞣质的含量测定

考察狗脊炮制前后鞣质含量变化情况。用络合法测定鞣质含量。结果 ,炮制后鞣质含量降低。狗脊炮制可使鞣质降低 ,若以鞣质为有效成分时 。

紫茎泽兰对金毛狗孢子萌发和配子体发育的化感作用

紫茎泽兰是我国外来入侵物种中危害最为严重的植物之一,广泛分布于我国西南地区,并有向东南部和中南部蔓延的趋势。本土濒危蕨类植物金毛狗的种群正受到紫茎泽兰的威胁。本研究将金毛狗的成熟孢子分别接种在含有不同浓度的紫茎泽兰根、茎、叶水提液的培养基上,观察记录金毛狗的孢子萌发和配子体发育过程。研究结果表明,紫茎泽兰根、茎、叶水提液均可对金毛狗的孢子萌发和假根生长产生抑制作用,表现为孢子萌发延迟,萌发率有所降低,假根伸长受到抑制,上述抑制作用随水提液浓度升高而增强。其中,叶水提液的抑制作用最强,随着叶水提液浓度的升高,配子体发育阶段滞后。由此可见,紫茎泽兰对金毛狗的孢子萌发和配子体发育具有化感作用。

重点保护药用植物金毛狗配子体发育过程的研究

目的:通过对金毛狗孢子萌发的研究,了解其生长发育规律,为金毛狗的室内培养与进一步研究提供理论和实践依据。方法:用土壤和Knop's培养基在室内培养金毛狗孢子,并在显微镜下观察记录孢子萌发及配子体发育全过程。结果:孢子播种1～2周左右萌发,萌发类型为书带蕨型;播种25d左右发育为片状体,毛状体出现在片状体形成之后,40d左右形成原叶体,成熟原叶体呈心脏形;精子器在接种后60d左右开始产生,颈卵器在精子器发生后10d左右形成。结论:室内土壤培养金毛狗孢子效果好,方法可行,是快速发展金毛狗的一条捷径。

SFE-RP-HPLC法测定金毛狗脊中磷脂含量

采用超临界CO_2流体萃取(SFE)金毛狗脊中磷脂类成分,通过均匀设计法考察了SFE的萃取条件,确定萃取压力为31.5MPa,温度为46.2℃,改性剂量为0.37L/kg药材,萃取时间设定为2h。然后采用反相高效液相色谱法,以Waters Symmetry C_(18)为固定相,甲醇-1.0％磷酸溶液(90∶10)为流动相,在检测波长为206nm条件下分离测定磷脂酰胆碱的含量为0.198％(RSD4.2％),为金毛狗脊及其制剂的质量控制提供了方法。

金毛狗配子体发育阶段性及其多样性研究

以国家二级重点野生保护植物金毛狗为研究对象,采用Knop’s固体与液体培养基培养其成熟孢子,通过显微互动系统详细记录配子体发育的过程,分析其阶段性和多样性,以期为揭示其生殖机理、制定保护对策提供理论依据。结果表明:(1)金毛狗孢子萌发表现为书带蕨型或桫椤型;(2)多数配子体发育无明显的丝状体阶段,而直接进入片状体阶段,这种发育方式在高密度的培养条件下更占优势;(3)金毛狗的配子体发育在2种培养基中表现出较大的差异性和多样性,在液体培养基中,部分丝状体会产生分枝,其中仅有1分枝发育成片状体,但在固体培养基中未观察到此现象;同时,前者的片状体形状表现为圆球形,后者一般表现为短舌状;(4)发育阶段的后期,成熟原叶体都趋向发育成对称的心脏形。

金毛狗脊的化学成分研究(Ⅱ)

目的 :研究金毛狗脊根的化学成分。方法 :采用超临界CO2 流体萃取技术提取其精油部分 ,经二级解析分离出精油Ⅰ和Ⅱ。并用GC -MS -联用技术进行分离和鉴定。结果 :以相对含量≥ 0 .1%计数 ,从精油Ⅰ和Ⅱ中分离出 43个化合物 ,鉴定了其中 2 5个化合物。其主要成分 (相对含量≥ 10 % )按由大到小排列分别为油酸、亚油酸、棕榈酸、十五碳酸、十六碳三烯酸甲酯、亚油酸甲酯。结论 :γ -松油烯等 12个化合物为首次从该植物中分离和鉴定。

金毛狗脊的化学成分研究(Ⅲ)

目的 对金毛狗脊Cibotiumbarometz(L .)J.Sm .根茎中化学成分进行分离鉴定 ,为进一步开发利用提供依据。方法 采用硅胶柱反复层析分离化合物 ,并通过理化数据和波谱数据确定其结构。结果 共分离鉴定了 12个化合物 ,即 :棕榈酸(I)、棕榈酸甲酯(Ⅱ )、亚油酸(Ⅲ )、油酸(Ⅳ )、硬脂酸乙酯(Ⅴ )、对羟基乙酰苯胺(Ⅵ )、蔗糖 (Ⅶ )、C2 7的饱和脂肪酸(Ⅷ )、原儿茶醛(Ⅸ )、β -谷甾醇 (Ⅹ )、香草醛(Ⅺ ) 和山奈素(Ⅻ )。 结论 化合物Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ为首次从该植物中分离得到。

药用蕨类植物狗脊内生真菌的初步研究

[目的]研究药用蕨类植物狗脊的内生真菌。[方法]首次从蕨类植物狗脊的根、茎、叶中分离获得内生真菌,光学显微镜下观察真菌的形态。[结果]从狗脊的根、茎、叶中共分离获得14株内生真菌,分属于3纲4目5科7属,多数属于半知菌,拟青霉属和拟盘多毛孢属为优势属,分别占总株数的28.57%和21.42%。狗脊的不同部位内生真菌的数量、分布、种群及组成存在差异。狗脊根、茎、叶分离内生真菌的频率顺序为:茎>根>叶,拟青霉属也是狗脊根、茎和叶内生真菌的优势种类。[结论]该研究丰富了内生真菌的生物种群。

狗脊不同炮制品中鞣质的含量测定

目的 :考察狗脊炮制前后鞣质含量变化情况。方法 :用干酪素法测定鞣质。结果 :炮制后鞣质含量降低。结论 :狗脊炮制可使鞣质含量降低 ,若以鞣质为有效成分时 ,用生品为宜。

濒危植物金毛狗的化学成分及其药理活性研究进展

本文综述了我国不同民族对濒危药用植物金毛狗的传统用途,介绍了从金毛狗中分离得到的蕨素类、萜类、甾体、黄酮类、芳香族、吡喃酮类等化学成分,并探讨了其在止血、抑菌、防治骨质疏松、抗癌、保肝等方面的药理活性,为更好地保护以及合理开发利用该濒危植物提供理论依据。