最新进展的转基因技术在骨与软骨缺损修复中的应用

背景:组织工程技术在骨与软骨的修复方面已经取得巨大进步,其中转基因技术的引入在最近几年也引起人们广泛的关注。目的:总结近5年来转基因技术在骨与软骨缺损修复中的最新研究进展。方法:应用计算机检索CNKI数据库和PubMed数据库2007年1月至2012年3月关于转基因技术治疗骨与软骨缺损方面的文献,中文检索词"基因,治疗,骨,软骨,缺损"。英文检索词"gene,therapy,bone,cartilage,defect",最终纳入22篇符合要求的文献。结果与结论:基因治疗为骨和软骨再生带来了一种新的治疗理念,它可以把具有特异性的目的基因精确转移入靶细胞内,并特异性的表达。目前应用于骨与软骨缺损的基因主要包括骨形态发生蛋白,转化生长因子,碱性成纤维细胞生长因子,胰岛素样生长因子,血管内皮细胞生长因子,Bcl-xl基因等。应用基因治疗可以诱导骨与软骨的形成,为骨与软骨的修复提供了崭新的途径。

碱性成纤维细胞生长因子对N-甲基-D-天冬氨酸诱导大鼠视网膜神经节细胞层损伤的保护作用

目的探讨玻璃体腔内注射碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导大鼠视网膜神经节细胞层损伤的保护作用。方法将健康雄性Wistar大鼠随机分入3组:空白对照组大鼠予玻璃体腔内注射磷酸盐缓冲液(PBS)4L,NMDA组大鼠予玻璃体腔内注射溶有100nmol NMDA的PBS4L,NMDA+bFGF组大鼠予玻璃体腔内注射溶有100nmol NMDA+20g bFGF的PBS 4L。注射24h后取视网膜组织切片行原位末端标记法(TUNEL)染色,观察细胞的凋亡率;提取视网膜蛋白质,采用Western印迹法检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白含量。注射7d后取视网膜组织切片行苏木精-伊红(H-E)染色,观察细胞的存活率。结果 NMDA组和NMDA+bFGF组的细胞凋亡率分别为(62.2±1.9)%和(43.3±1.9)%,均显著高于空白对照组的(2.4±1.6)%(P值均<0.01),NMDA+bFGF组的细胞凋亡率显著低于NMDA组(P<0.01)。NMDA组和NMDA+bFGF组的细胞存活率分别为(37.9±7.9)%和(66.7±6.1)%,均显著低于空白对照组的(96.0±3.4)%(P值均<0.01),NMDA+bFGF组的细胞存活率显著高于NMDA组(P<0.01)。NMDA组和NMDA+bFGF组的Bcl-2/Bax比值分别为0.3±0.1和0.6±0.1,均显著低于空白对照组的0.8±0.1(P值均<0.01),NMDA+bFGF组的Bcl-2/Bax比值显著高于NMDA组(P<0.01)。结论 bFGF能逆转NMDA对视网膜神经节细胞层的损伤作用,起到有效的神经保护作用。

碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白在Origami2体系中的可溶表达及二者促成骨的协同效应

目的建立优化高效的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP-2)蛋白重组方法,阐明二者在促成骨中的协同效应。方法优化bFGF和BMP-2成熟肽的基因序列密码子,获得适用于大肠杆菌Origami2体系表达的bFGF及BMP-2成熟肽cDNA片段;利用PCR法将bFGF成熟肽cDNA片段插入原核表达质粒pColdⅡ中,构建重组原核表达质粒pColdⅡ-bFGF;利用PCR法将BMP-2成熟肽cDNA片段插入原核表达质粒pET-30a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-30a(+)-BMP-2,转入大肠杆菌Origami2中表达纯化;运用双酶切、质粒测序及Western blot技术证明Origami2表达体系的构建效果;进行细胞增殖实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)染色观察和体内成骨效率检测等,探索bFGF、BMP-2在促成骨中的协同效应。结果双酶切和质粒测序鉴定证明成功构建重组大肠杆菌pColdⅡ-bFGF/Origami2和pET30a(+)-BMP-2/Origami2表达体系,Western blot检测发现蛋白正确表达。经过Ni-NTA亲和层析纯化后bFGF及BMP-2纯度高达90%。通过对二者比例的优化筛选,发现40 ng/mL bFGF+40 ng/mL rh BMP-2时,大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖效率、ALP活性及体内成骨效率最高,是二者促成骨的最优效组合。结论成功构建高效表达的pColdⅡ-bFGF/Origami2和pET30a(+)-BMP-2/Origami2表达体系,实现了bFGF及BMP-2的高效表达。bFGF和BMP-2的优化联合应用具有促成骨协同效应。