小鼠bcl10基因敲除载体的构建

根据已知的cDNA序列设计引物 ,通过RT PCR获得小鼠bcl10基因cDNA片段作为探针 ,用噬斑原位杂交法克隆 12 9品系小鼠的bcl10基因组DNA ,在亚克隆完成序列结构分析的基础上 ,利用常规分子克隆技术 ,构建完成了针对bcl10基因的替代型基因敲除载体。两条同源臂分别为bcl10基因exon3上游 2 .4kb和exon4下游 4 .5kb的基因片段。构建完成替代型小鼠bcl10基因敲除载体 ,为后续获得bcl10基因缺陷型胚胎干细胞系奠定了实验基础。

人天然免疫基因BCL10的猪同源物的识别、克隆与初步表达分析

采用电子克隆方法克隆到大小为925bp的人天然免疫蛋白BCL10的猪同源基因完整cDNA序列(GenBank登录号:EU088132),并利用RT-PCR方法从猪的全血中扩增出包含702bp的完整开放读码框架(ORF)的cDNA片段。经核酸测序,证明与电子克隆结果相符。利用NCBIBLAST分析该cDNA包含3个大小为57bp、289bp和356bp的外显子,并且定位于猪的4号染色体上。采用半定量PCR技术检测基础水平猪各组织BCL10基因mRNA表达丰度,并将该基因构建到带有绿色标签的真核表达载体pEGFP-C1中,采用脂质体转染法将该基因转入PK-15细胞,通过绿色荧光标记和RT-PCR方法检测实验组的BCL10蛋白表达。研究结果表明,BCL10基因mRNA在脾脏中表达最高;胸腺、大脑和淋巴结表达次之,而肝脏只有微量表达,肾脏没有检测到表达;同时BCL10基因在PK-15细胞中得到了有效表达。

BCL10、Nramp1基因多态性与大白仔猪断奶前腹泻关联分析

为研究大白猪BCL10基因和Nramp1基因的单核苷酸多态性,并寻找与大白仔猪断奶前腹泻相关的分子标记,构建490头大白仔猪群体,对仔猪断奶前腹泻情况进行统计,利用PCR-RFLP法检测BCL10基因3′端1149T/C位点和Nramp1基因第六内含子NdeⅠ酶切位点多态性,同时与腹泻频率、腹泻指数和部分生长性状进行关联分析。结果显示:大白仔猪断奶前腹泻率为32.0%,重度腹泻个体的21日龄平均断奶重比正常个体低13.0%,日增重低16.2%,而且大白仔猪在7~11日龄和17~21日龄存在2个断奶前腹泻小高峰。仔猪腹泻粪便病原检测结果表明,22.5%的样本检出为沙门氏菌感染,17.5%的样本检出为致病性大肠杆菌感染。关联分析结果表明:BCL10基因多态性与初生重相关联(P<0.05),TT型个体初生重大于TC型个体,差异显著(P<0.05);BCL10基因多态性与腹泻频率、腹泻指数相关联,差异极显著(P<0.01),个体腹泻频率、腹泻指数均表现为TT>TC>CC,CC与TC之间差异显著(P<0.05),CC与TT之间差异极显著(P<0.01);Nramp1基因多态性与腹泻频率、腹泻指数相关联,差异极显著(P<0.01),个体腹泻频率、腹泻指数均为AA、AB型大于BB型,且AA型与BB型差异显著(P<0.05),AB型与BB型差异极显著(P<0.01)。研究结果表明,BCL10基因和Nramp1基因不同基因型对大白仔猪断奶前腹泻有显著影响,Nramp1基因与猪沙门氏菌感染导致的腹泻有关,BCL10基因3′端1149T/C位点和Nramp1基因第六内含子NdeⅠ酶切位点可以作为大白仔猪断奶前抗腹泻育种分子标记。

山羊先天免疫基因BCL10克隆、组织表达及真核载体构建分析

本研究旨在探索作为先天免疫相关分子的BCL10蛋白对山羊的免疫调控。实验采用RT-PCR、3'RACE和5'RACE克隆方法,以NCBI中山羊BCL10预测基因序列为模板,克隆初生羔羊脾脏组织BCL10基因cDNA序列,并进行生物信息学分析;采用qRT-PCR技术检测羔羊BCL10基因各免疫相关组织转录表达谱;鉴定p EGFP-N1-BCL10重组质粒在细胞的真核表达效果。结果表明:克隆得到BCL10基因cDNA全长1 023 bp,其中CDS为693 bp,编码230个氨基酸;生物信息学分析结果发现山羊BCL10蛋白是一种N端存在CARD结构域、非分泌、非膜结合的胞内蛋白,氨基酸序列与水牛、绵羊的亲缘关系最为接近;颌下腺中BCL10基因表达量显著高于肺脏、肝脏、脾脏、肾脏及血液(P<0.05),胸腺中BCL10基因表达量显著高于血液(P<0.05),血液表达最少;成功构建了BCL10基因完整CDS序列的p EGFP-N1-BCL10重组载体,并在HEK293T真核细胞正常表达。本研究首次克隆出羊BCL10基因cDNA全长序列,检测了基因表达分布情况,构建了重组载体,为进一步探索山羊BCL10基因功能及蛋白免疫机制提供理论基础。

鸡BCL10基因的克隆与表达

通过电子克隆手段,克隆到大小为959bp的cDNA序列。然后从鸡的脾脏提取RNA,用RT-PCR方法扩增出目的片段。将该片段连接到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-C1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pET-BCL10在大肠杆菌中的表达,脂质体转染法将真核表达载体pEGFP-BCL10转入vero细胞,Western blotting检测其在细胞中的表达。结果显示,PCR扩增到735bp的DNA片段,原核表达载体和真核表达载体经双酶切和核酸测序表明载体构建成功。SDS-PAGE电泳检测到pET-BCL10重组质粒在大肠杆菌中表达。Western blotting检测到pEGFP-BCL10重组质粒在vero细胞中表达。结论表明,BCL10基因在鸡体内存在,该基因的重组质粒能在大肠杆菌和vero细胞中表达。

急性髓系白血病BCL2L10基因启动子区异常甲基化定量研究

目的:定量研究急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中BCL2L10基因启动子区异常甲基化状态,探讨其与AML的临床关系。方法:应用焦磷酸测序法,对62例原发AML患者的骨髓进行BCL2L10基因启动区甲基化水平的定量检测,并以10例缺铁性贫血和巨幼细胞性贫血的骨髓标本及10例健康人外周血标本作为对照。结果:62例AML中32例标本BCL2L10基因启动区高甲基化,阳性率为51.6%,而20例对照组中1例标本BCL2L10基因启动区高甲基化,阳性率为5.0%;BCL2L10基因在AML患者中的高甲基化阳性率显著高于对照组(P<0.01);BCL2L10基因的甲基化状态与AML患者的年龄、性别及临床分型间均未出现显著相关性(P>0.05)。结论:BCL2L10基因启动子区异常甲基化在AML中普遍存在,其可能是引起AML的分子机制之一。

BCL2L10基因表达及其启动子甲基化在骨髓增生异常综合征中的临床意义

目的探讨骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者骨髓细胞中BCL2L10的表达及其启动子甲基化状态的临床意义。方法采用real-time PCR方法对56例MDS患者(MDS组)以及30例非白血病患者(非白血病对照组)骨髓标本的BCL2L10基因表达水平进行定量检测,MDS患者按修正的国际预后积分系统(IPSS-R评分)分为低/中危MDS组(IPSS-R评分≤4.5,33例)和高危MDS组(IPSS-R评分>4.5,23例)。采用甲基化特性PCR分析BCL2L10基因启动子区甲基化状态,同时在临床MDS样本和GEPIA数据库中对比分析BCL2L10表达水平与疾病预后的关系。结果MDS组患者BCL2L10基因表达水平较非白血病对照组显著降低(P<0.05),高危MDS组患者骨髓标本中BCL2L10基因表达水平显著低于非白血病对照组和低/中危MDS组(P<0.05)。BCL2L10基因表达水平受甲基化调控,高危MDS组患者BCL2L10基因启动子区甲基化阳性率(56.52%)明显高于非白血病对照组(36.67%,P<0.05)及低/中危MDS组(30.30%,P<0.05);且BCL2L10基因启动子区甲基化状态与MDS患者的危险度分层密切相关(χ~2=5.79,P<0.05),而与年龄、性别无统计学差异(P>0.05)。在24例未予以甲基化药物治疗的患者中,BCL2L10高表达组患者3年生存率低于BCL2L10低表达组(83.3%vs 50.0%),采用GEPIA数据库对BCL2L10在急性髓系白血病中进行预后比较,同样发现低表达组的预后较高表达组差,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论BCL2L10基因表达水平及其甲基化状态可作为判断MDS预后的指标之一。

BCL10高表达引起脾脏边缘带B细胞抗凋亡而致其体内增生

目的以Eμ-BCL10转基因(transgenic,Tg)小鼠为模型研究BCL10高表达引起MALT淋巴瘤发病的分子机制。方法 PCR鉴定Eμ-BCL10转基因小鼠,Western blotting检测BCL10转基因蛋白的表达,组织学方法显示BCL10Tg小鼠脾脏MALT淋巴瘤的前体细胞-边缘带(marginalzone,MZ)B细胞扩增,流式细胞仪鉴定脾脏边缘带B细胞并分离出这群B细胞用于抗凋亡机制的研究,使用Annexin V-FITC/PI双染法经流式细胞仪检测边缘带B细胞凋亡情况。结果 PCR鉴定BCL10转基因阳性(Tg/+)小鼠,Western blotting证明内源性BCL10蛋白在Tg/+和非转基因野生型(widetype,WT)小鼠中表达的水平相同;BCL10Tg/+小鼠BCL10蛋白的表达量是WT小鼠的2倍。组织学染色显示,BCL10Tg/+小鼠脾脏增生的B细胞可能是边缘带B细胞,将这群B细胞用CD21、CD23染色并经流式细胞仪分析,证明这群增生的B细胞正是CD21high/CD23low的边缘带B细胞。为了进一步研究边缘带B细胞的增生机制,采用CD43、CD23双染,然后通过流式细胞仪分选出BCL10Tg/+以及WT小鼠的边缘带B细胞。BCL10Tg/+小鼠的边缘带B细胞群约30%可以在含5%FBS的RPMI-1640中存活1周以上,而WT小鼠的边缘带B细胞群在第3天几乎全部死亡(P<0.01),这一结果说明,BCL10的高表达引起边缘带B细胞的抗凋亡效应。Anti-IgM诱导边缘带B细胞凋亡实验结果显示,BCL10高表达保护anti-IgM诱导的细胞凋亡。结论 BCL10高表达引起脾脏边缘带B细胞扩增,扩增的B细胞具有抗凋亡特性,这种抗凋亡特性影响抗原受体信号传导途径。这些结果可以在一定程度上解释因BCL10高表达而引起的MALT淋巴瘤的发病分子机制。