miR-153-3p靶向结合BCL2基因调控鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期的实验研究

目的探讨miR-153-3p调控鼻咽癌细胞增殖、凋亡和周期的作用。方法利用生物信息学软件对miR-153-3p的候选靶基因进行预测。实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测miR-153-3p对细胞内mRNA和蛋白表达的影响。用密理博MUSETM细胞检测仪对细胞周期和细胞凋亡情况进行检测。用CCK8法和克隆技术形成实验检测细胞增殖能力。结果生物信息学预测结果显示,miR-153-3p与BCL2分子之间存在一个高可信度的结合区。miR-153-3p mimic能上调miR-153-3p的表达,降低BCL2蛋白的表达。与对照组相比,过表达miR-153-3p的6-10B细胞的凋亡明显增加,增殖能力受到显著抑制。结论miR-153-3p通过下调BCL2的表达,能够促进鼻咽癌细胞凋亡,抑制其增殖。

人Bcl2基因真核表达载体的构建及其抗凋亡功能研究

目的:构建带myc标签的Bcl2真核表达载体,获得myc-Bcl2融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Bcl2编码序列,将其插入p CMV-myc载体,Western印迹检测表达情况;将重组质粒与空载体分别转染乳腺癌MCF-7细胞,通过流式细胞仪检测p CMV-myc-Bcl2重组质粒对细胞凋亡的影响。结果:双酶切和测序结果表明p CMV-myc-Bcl2真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后myc-Bcl2蛋白成功表达;流式细胞仪检测结果显示,myc-Bcl2明显抑制乳腺癌细胞系的凋亡。结论:构建了带myc标签的人Bcl2真核表达载体,为进一步研究Bcl2在细胞凋亡中的功能奠定了基础。

细胞凋亡反应中NOXA基因启动子发挥增强子功能调节BCL2基因表达

真核生物基因的转录受到近端启动子和远端增强子的共同调控,部分基因的启动子可兼具有增强子的活性。NOXA与BCL2分别是BCL2蛋白家族促凋亡和抗凋亡成员。本课题组前期研究发现,NOXA基因启动子与BCL2基因启动子在染色质三维空间结构上存在相互作用,且NOXA基因启动子区兼有启动子和增强子特征性的组蛋白修饰标记。为进一步探究NOXA启动子是否具有增强子活性、能否在细胞凋亡过程中作为增强子调控BCL2基因表达,本研究利用染色质构象捕获(chromosome conformation capture,3C)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和荧光素酶报告基因等检测技术在喜树碱诱导的MCF-7细胞凋亡模型中证实,NOXA启动子兼具增强子活性,并可通过形成染色质环结构远程调控BCL2基因表达。NOXA启动子的调控属性与凋亡信号强弱密切相关,在较弱凋亡信号刺激下(1μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子主要发挥增强子功能;随着凋亡刺激信号的加强(10μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子活性增强,主要调控其基因自身的表达,促进细胞凋亡。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)证实NOXA启动子区启动子活性和增强子活性的动态变化与其组蛋白修饰标志一致。本研究为进一步探讨BCL2家族成员对细胞凋亡刺激做出协同反应的机制提供了新的线索。

Bcl2基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤大鼠实验研究

目的探究Bcl2基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗脊髓损伤大鼠的疗效及作用机制。方法分离培养大鼠BMSCs并采用Bcl2转染BMSCs建立鼠脊髓损伤模型,随机分为模型组、BMSCs组及Bcl2+BMSCs组,另选取36只健康大鼠作为对照组。脊髓损伤1周后对BMSCs组大鼠进行BMSCs移植,对Bcl2+BMSCs组大鼠移植经Bcl2转染的BMSCs,对照组及模型组大鼠注射等量生理盐水。移植术后,采用Western blot检测不同时间脊髓损伤周边区Bcl2表达水平,原位末端标记法(TUNEL)染色检测细胞凋亡情况,免疫组化检测神经丝蛋白200(NF-200)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达量,HE染色探究大鼠脊髓组织及脊髓神经细胞变化,运动功能评分(BBB)评估各组大鼠运动功能恢复情况。结果细胞移植治疗后,Bcl2+BMSCs组大鼠Bcl2蛋白相对表达量显著高于其他3组,TUNEL染色阳性细胞数显著低于模型组及BMSCs组,NF-200蛋白阳性面积高于模型组及BMSCs组,GFAP蛋白阳性面积低于模型组及BMSCs组,差异具有统计学意义(P<0.05)。移植治疗1周后,Bcl2+BMSCs组大鼠脊髓组织细胞及脊髓神经细胞状态、BBB评分均优于模型组和BMSCs组。结论Bcl2基因修饰BMSCs移植治疗脊髓损伤大鼠,能显著抑制细胞凋亡,促进神经功能恢复,疗效显著。

沉默Bcl2、Bak1基因表达对成骨肉瘤MG-63细胞增殖及成骨能力的影响

目的探讨沉默Bcl2、Bak1基因表达对成骨肉瘤MG-63细胞增殖及成骨能力的影响。方法收集对数生长期MG-63细胞,随机分为sh Bcl2组、sh Bak1组、共转染组和空白对照组。sh Bcl2组、sh Bak1组、空白对照组分别单独转染sh Bcl2、sh Bak1重组腺病毒和空载腺病毒,共转染组同时转染sh Bcl2及sh Bak1重组腺病毒。转染48 h,采用MTT法检测细胞增殖率,对硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,Western blotting法检测成骨相关蛋白骨形态发生蛋白4(BMP4)、骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2(Runx2)、TNF-α表达。结果 sh Bcl2组细胞增殖率、ALP活性及BMP4、OPN、Runx2相对表达量均低于空白对照组,TNF-α相对表达量高于空白对照组(P均<0.01)。sh Bak1组细胞增殖率、ALP活性及BMP4、OPN、Runx2相对表达量均高于空白对照组,TNF-α相对表达量低于空白对照组(P均<0.01)。空白对照组与共转染组细胞增殖率、ALP活性、BMP4、OPN、Runx2、TNF-α相对表达量比较均无统计学差异(P均>0.05)。结论沉默Bcl2基因表达可抑制MG-63细胞增殖及成骨能力,沉默Bak1基因则具有相反的作用;Bcl2与Bak1共同参与MG-63细胞的凋亡及成骨过程。

卵巢上皮癌bcl-2、p53基因与多药耐药的相关研究

目的 探讨卵巢上皮癌bcl—2、p53基因与肿瘤多药耐药的相关关系。方法 用免疫组化LSAB法检测70例卵巢上皮癌和15例交界瘤的bcl—2、p53基因水平的表达。结果 卵巢癌的bcl—2基因水平呈低表达,浆液性癌、粘液性癌的bcl—2基因表达率分别为11％(5/45)和20％(5/25),交界瘤呈阴性反应。p53抑制基因在浆液性癌、粘液性癌和交界瘤的表达率则分别为77％、72％和0％,P—gp基因在卵巢癌呈高表达,上述三类标本的阳性率分别为88％、80％及33％。结论 bcl—2与p53基因水平的表达与肿瘤细胞的多药耐药相关,bcl—2可作为预测肿瘤预后及药物敏感性的重要指标之一。

培多普利对自发性高血压大鼠心室重塑过程中左室心肌细胞凋亡和Bcl_2、Bax基因表达的影响

为研究培多普利对自发性高血压大鼠 (SHR)左室心肌细胞凋亡和 Bcl2 、Bax基因表达的影响 ,采用 TUNEL技术及 DNA电泳研究心肌细胞凋亡 ;原位杂交研究 Bcl2 、Bax基因表达。结果显示 :培多普利 1抑制左室心肌细胞凋亡发生 ,2使 Bcl2 / Bax基因表达比率恢复正常。提示 :培多普利使 SHR心肌 Bcl2 / Bax表达比率恢复正常是其抑制心室重塑过程中心肌细胞凋亡的重要机制。

大肠癌组织中bcl-2和bax基因蛋白表达及临床意义

目的 探讨bcl- 2和bax蛋白在大肠癌表达及其与肿瘤发生、浸润及预后的关系。方法 应用免疫组化催化信号放大系统(CSA)检测 90例大肠癌bcl- 2和bax蛋白的表达状况。结果 大肠癌组织bcl- 2阳性率显著高于正常大肠粘膜组织 (67.8%比36 .7% ,P <0 .0 5) ;bax蛋白表达阳性率显著低于正常大肠粘膜组织 (43 .3 %比 66 .7% ,P <0 .0 5)。结论 大肠癌组织中有不同水平的bcl- 2蛋白高表达和bax蛋白的低表达 ,两者通过参与调节细胞凋亡而与大肠癌的发生及化疗效果有关 ,但与大肠癌病理类型、浸润程度、临床分期及患者生存状态无关。

应用RNAi沉默STAT3基因促裸鼠移植瘤细胞凋亡及对Bax/Bcl-2基因表达的影响

目的应用RNAi技术沉默信号转导子与转录活化子3(STAT3)基因,探讨其对人乳腺癌裸鼠移植瘤的细胞凋亡及其对Bax/Bcl2基因表达的影响。方法于雌裸鼠皮下种植MCF7细胞,肿瘤长至一定大小时,随机分为盐水对照(A)组、空质粒对照(B)组及实验(C)组。于肿瘤局部分别注射盐水、psilencer1.0U6空质粒和psilencer1.0U6STAT3siRNA重组质粒。当A组肿瘤长至足够大时处死全部动物,取肿瘤,测其大小及重量,行HE及免疫组化染色,同时用Westernblot检测STAT3,Bax,Bcl2基因的表达水平。结果C组肿瘤瘤块的体积和重量明显小于A,B组(P<0.01)。免疫组化及HE显示C组肿瘤中心区出现大面积细胞坏死及细胞凋亡征象,STAT3免疫组化呈阴性,而A,B组无此现象。Westernblot显示C组STAT3的表达明显低于A,B组(P<0.01),而Bax的表达明显高于A,B组(P<0.05),各组Bcl2的表达水平差异无显著性(P<0.05)。结论应用RNAi技术沉默STAT3基因可以降低人乳腺癌裸鼠移植瘤中STAT3的表达,同时引起Bax基因的表达上调,导致细胞凋亡进而抑制肿瘤的生长。

硼替佐米上调fas、bcl2l12、caspase-9和caspase-3基因表达

目的:探讨硼替佐米诱导慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞凋亡及新基因bcl2l12在其中的作用。方法:MTT比色法观察硼替佐米对K562细胞的生长抑制作用;Annexin-V标记和线粒体跨膜电位(Δψm)分析细胞凋亡;RT-PCR方法检测0、6、12和24hfas、bcl2l12、bcl-2、bim、bax、caspase-3和caspase-9基因表达变化。结果:硼替佐米抑制K562细胞生长呈时间和剂量依赖性,24h和48h半数抑制浓度分别为161.41nmol/L和96.33nmol/L;硼替佐米诱导K562细胞凋亡,12h Annexin-V阳性细胞就开始增高,并呈时间依赖性,Δψm减低;RT-PCR显示fas、bcl2l12、caspase-3和caspase-9表达增高,但bcl-2、bim和bax表达无明显改变。结论:硼替佐米可以抑制K562生长并诱导凋亡,上调fas、bcl2l12,使线粒体膜电位下降,激活caspase-9和caspase-3基因,促使DNA发生断裂可能是其诱导凋亡的机制之一。

介入化疗对肺癌凋亡相关基因Bcl-2及Fas蛋白表达的影响

目的 观察支气管动脉插管经导管灌注化疗药物 (以下简称介入化疗 )对肺癌凋亡相关基因Bcl-2及Fas蛋白表达的影响。方法 应用免疫组织化学法回顾性研究了 14例介入化疗前后肺癌组织标本Bcl-2及Fas蛋白的表达。结果 介入化疗后Bcl- 2蛋白表达评分 (2 .0 7± 1.38)明显低于介入化疗前Bcl- 2蛋白表达评分 (3.14± 1.35 ,P <0 .0 5 ) ;介入化疗后Fas蛋白表达评分 (4 .2 9± 1.82 )明显高于介入化疗前Fas蛋白表达评分 (2 .5 0± 1.74 ,P <0 .0 5 )。结论 介入化疗对肺癌凋亡相关基因Bcl- 2蛋白表达有抑制作用 ,对Fas蛋白表达有促进作用 ;介入化疗可能是通过抑制Dcl— 2基因表达和促进Fas基因表达而诱导肺癌细胞凋亡的。

急性髓系白血病BCL2L10基因启动子区异常甲基化定量研究

目的:定量研究急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中BCL2L10基因启动子区异常甲基化状态,探讨其与AML的临床关系。方法:应用焦磷酸测序法,对62例原发AML患者的骨髓进行BCL2L10基因启动区甲基化水平的定量检测,并以10例缺铁性贫血和巨幼细胞性贫血的骨髓标本及10例健康人外周血标本作为对照。结果:62例AML中32例标本BCL2L10基因启动区高甲基化,阳性率为51.6%,而20例对照组中1例标本BCL2L10基因启动区高甲基化,阳性率为5.0%;BCL2L10基因在AML患者中的高甲基化阳性率显著高于对照组(P<0.01);BCL2L10基因的甲基化状态与AML患者的年龄、性别及临床分型间均未出现显著相关性(P>0.05)。结论:BCL2L10基因启动子区异常甲基化在AML中普遍存在,其可能是引起AML的分子机制之一。

BCL2L12基因治疗对于小鼠阿尔兹海默病的影响及机制

目的观察BCL2L12基因治疗对于阿尔茨海默病模型小鼠行为学及分子病理学的影响。方法应用立体定向仪将携带空壳基因及BCL2L12基因的腺相关病毒注射至C57小鼠海马CA1区,2周后相同部位注射Aβ(1μg),2周后进行行为学实验及免疫组织化学染色(6E10及AT8)。结果旷场实验发现,空壳基因治疗组与目的基因治疗组在中心区的时间与记录总时间的比值显著低于空白对照小鼠,两治疗组之间差异无统计学意义。水迷宫实验发现,目的基因治疗组及空白对照组平均潜伏期均于第2天显著缩短,而空壳基因治疗组平均潜伏期于第3天显著缩短。6E10及AT8免疫荧光染色发现空壳基因治疗组及目的基因治疗组小鼠染色脑片平均吸光度显著高于空白对照组小鼠,空壳基因治疗组小鼠染色脑片平均吸光度高于目的基因治疗组小鼠,但差异无统计学意义。结论应用BCL2L12基因治疗无法改善AD小鼠的焦虑情绪,但是可以提高AD小鼠的学习记忆功能,可能与BCL2L12基因治疗减少Aβ沉积以及Tau蛋白磷酸化有关。

金川牦牛BCL2A1基因克隆及生物信息学分析

为探讨金川牦牛抗凋亡因子——B淋巴细胞瘤2相关蛋白A1(B cell lymphoma 2related A1,BCL2A1)基因特点,本试验采用PCR方法以金川牦牛血液DNA为模板扩增BCL2A1基因,用DNAStar、ExPASy、ABCpred等生物信息学软件分析基因序列和蛋白质结构。结果显示,克隆获得的片段长622bp,GenBank登录号:MG459158,开放阅读框为516bp,共编码171个氨基酸,其中缬氨酸(V)、赖氨酸(K)的含量较多,分别为9.4%和8.8%。BCL2A1分子质量为19.46ku,理论等电点为4.99,不稳定系数为17.44,具有跨膜螺旋结构域(Scores>500)。二级结构主要为α-螺旋,占60.82%,有一个BCL2结构域,三级结构模型与人BCL2A1同源性最高(72.79%),BCL2A1存在潜在的B细胞抗原表位。与野牦牛氨基酸序列进行比对显示,金川耗牛BCL2A1存在5个氨基酸差异位点。NJ法系统进化分析显示,金川牦牛与野牦牛同源性为98.5%,亲缘关系最近。本试验成功克隆了金川牦牛BCL2A1基因,其在哺乳动物中具有较高的保守性,为深入研究牦牛BCL2A1基因功能提供理论依据。

miR-222通过调控BCL2L13基因促进HBx-HepG2细胞生长

目的:探讨HBx-Hep G2细胞中微小RNA-222(mi R-222)对BCL2L13基因表达的调控作用以及对细胞生长和凋亡的影响,并研究其潜在的分子作用机制。方法:利用实时荧光定量PCR检测mi R-222的表达水平;MTT和集落形成实验检测细胞的生长;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;构建BCL2L13 3’UTR双萤光素酶报告载体,通过采用双萤光素酶报告实验验证mi R-222的靶基因。结果:与正常的肝细胞L02相比,mi R-222在HBx-Hep G2细胞过量表达(P<0.05)。mi R-222过表达可促进HBx-Hep G2细胞的生长,改变细胞周期,降低细胞的凋亡率;mi R-222表达下调可抑制HBx-Hep G2细胞的生长,改变细胞周期,增加细胞的凋亡率,和对照组相比差异有统计学显著性(P<0.05)。与正常肝细胞L02相比,BCL2L13在HBx-Hep G2细胞表达下调(P<0.05);mi R-222表达下调可促进BCL2L13的表达(P<0.05)。双萤光素酶报告实验和pc DNA3.1-BCL2L13转染实验结果提示mi R-222可以通过作用于BCL2L13的3’UTR区,负向调控其表达,从而促进细胞的生长。结论:mi R-222可以通过靶向调控BCL2L13基因进而促进HBx-HepG2细胞的生长。

BCL2L10基因表达及其启动子甲基化在骨髓增生异常综合征中的临床意义

目的探讨骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者骨髓细胞中BCL2L10的表达及其启动子甲基化状态的临床意义。方法采用real-time PCR方法对56例MDS患者(MDS组)以及30例非白血病患者(非白血病对照组)骨髓标本的BCL2L10基因表达水平进行定量检测,MDS患者按修正的国际预后积分系统(IPSS-R评分)分为低/中危MDS组(IPSS-R评分≤4.5,33例)和高危MDS组(IPSS-R评分>4.5,23例)。采用甲基化特性PCR分析BCL2L10基因启动子区甲基化状态,同时在临床MDS样本和GEPIA数据库中对比分析BCL2L10表达水平与疾病预后的关系。结果MDS组患者BCL2L10基因表达水平较非白血病对照组显著降低(P<0.05),高危MDS组患者骨髓标本中BCL2L10基因表达水平显著低于非白血病对照组和低/中危MDS组(P<0.05)。BCL2L10基因表达水平受甲基化调控,高危MDS组患者BCL2L10基因启动子区甲基化阳性率(56.52%)明显高于非白血病对照组(36.67%,P<0.05)及低/中危MDS组(30.30%,P<0.05);且BCL2L10基因启动子区甲基化状态与MDS患者的危险度分层密切相关(χ~2=5.79,P<0.05),而与年龄、性别无统计学差异(P>0.05)。在24例未予以甲基化药物治疗的患者中,BCL2L10高表达组患者3年生存率低于BCL2L10低表达组(83.3%vs 50.0%),采用GEPIA数据库对BCL2L10在急性髓系白血病中进行预后比较,同样发现低表达组的预后较高表达组差,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论BCL2L10基因表达水平及其甲基化状态可作为判断MDS预后的指标之一。

脂质体转染bcl-2反义寡核苷酸G3139在HL-60细胞中的动力学模式

目的 应用阳离子脂质体介导或直接转染时 ,建立HL 6 0细胞摄入由 5 FITC标记的bcl 2反义寡核苷酸G3139的动力学模式及观察G 3139在细胞内的分布。方法 流式细胞仪测定细胞内的相对平均荧光强度 ,荧光显微镜观察细胞内的荧光分布。结果 ①脂质体介导转染法显著提高HL 6 0细胞对G 3139的摄入 ,当DOSPER/G 3139(μg/μg)为 2 2 / 1时 ,细胞内相对平均荧光强度可达G 3139直接作用时的 40倍 ,而且HL 6 0细胞对G 3139的摄入跟G3139的浓度和作用时间有关。②细胞内的G 3139可向胞外转运 ,在DOSPER介导转染后 ,胞内荧光强度衰减缓慢 ,t1/ 2 约为 4h ,而G 3139直接作用后 ,t1/ 2 约为 0 5h ;③DOSPER介导转染 6h后 ,细胞内荧光物质主要以明亮的点状聚集在细胞核和部分细胞浆的细胞器中 ,而G 3139直接作用时 ,荧光物质则弥漫分布于胞浆中。结论 DOSPER可以增加G 3139的细胞摄入并改变其胞内分布 ,可能是阳离子脂质体增加bcl 2反义寡核苷酸生物活性的重要原因。

Bcl-2反义硫代磷酸寡核苷酸对HL60细胞生长的影响

应用Bcl-2反义硫代磷酸寡核苷酸(ASPO)与HL60细胞共培养,旨在观察不同浓度ASPO对HL60细胞生长和克隆形成的影响。结果发现,与Bcl-2正义寡核苷酸(SPO)及空白组比较,不同浓度的ASPO(A5μmol/L,A10μmol/L,A20μmol/L)培养24小时即可降低HL60细胞生长数和CFU-HL60克隆形成率。并随浓度的增大而显著(P<0.01)。72小时以后,ASPO组则与SPO组和空白组无显著差别(P>0.05)。因此认为Bcl-2的ASPO具有抑制HL60细胞生长,并呈浓度依赖性和序列特异性。