利用Sleeping beauty转座子系统构建响应IFNβ的荧光转基因小鼠

干扰素β(interferon β,IFNβ)在抗病毒感染、免疫调节及肿瘤治疗中发挥重要作用。近年来,越来越多的证据表明IFNβ能显著增强树突状细胞(dendritic cell,DC)的抗原呈递能力以及T细胞的活性。然而目前针对IFNβ在病毒入侵和肿瘤发生过程中如何诱发全身性免疫应答的机制尚不清楚,这极大地限制了大家对病毒感染和肿瘤免疫的理解。因此,在这一过程中检测释放IFNβ的细胞种类以及IFNβ在各组织中的表达水平显得尤为重要。目前将外源DNA序列插入到宿主基因组中仍然需要合成或克隆同源模板,这会花费大量的时间成本,且效率不高。在这里,该研究利用Sleeping beauty转座子/转座酶系统构建了由IFNβ启动子诱导表达红色荧光蛋白的转基因小鼠模型(C57BL/6)。通过PCR及流式细胞术证实,小鼠中的外源基因经过数次传代仍然稳定表达。这些结果表明,该研究成功构建了由IFNβ启动子诱导稳定表达mCherry的转基因小鼠模型。这一模型为进一步研究干扰素通路在抗肿瘤和抗病毒中的功能提供有用的工具。

转座子Sleeping Beauty和PiggyBac

近10年来,得益于转座子Sleeping Beauty(SB)和PiggyBac(PB)的发现和完善,转座子作为一种遗传工程工具在脊椎动物的基因遗传研究中得到广泛应用.SB和PB宿主范围极其广泛,从单细胞生物到哺乳动物都能够发挥作用.转座过程需要转座序列和转座酶的存在,类似于"剪切"、"粘贴"的方式.转座子载体系统转座时可携带一段外源DNA序列,利用这一特性可以用于实现目的基因的转移,现已广泛用于转基因动物、基因功能研究、基因治疗等领域.当转座系统与基因捕获技术相结合,不仅可研究插入突变基因的功能,还能通过所携带的报告基因获得捕获基因的表达图谱.作为非病毒载体的SB和PB转座系统,由于具有高容量、高效率和高安全性等优势,并且PB在转座后不留任何足迹,不会造成遗传物质的不可预测改变,在动物基因工程以及基因治疗方面具有诱人的前景.

利用Ac/Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记转基因植株的方法

获得无选择标记转基因植株是进行重复转基因及消除转基因植株中标记基因潜在危害性的关键。实验采用了Ac Ds转座子系统在水稻 (OryzasativaL .)中进行无hpt选择标记的转基因。将含有目的基因bar的Ds元件和hpt标记基因置于同一个T_DNA中 ,通过农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)EHA10 5介导将Ac_T_DNA及Ds_T_DNA分别转入到不同的水稻植株 ,再将单拷贝的Ac_T_DNA植株与单拷贝的Ds_T_DNA植株杂交得到同时含有Ac和Ds元件的F1 植株 ,F1 自交产生F2 后代 ,F2 植株中转座后的Ds元件与T_DNA独立分离 ,在总共 10 0株F2 水稻植株中筛选得到 2株只含有Ds元件插入而无hpt标记基因的转基因水稻植株。结果表明 ,利用Ac Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记的转基因植株是可行的。

利用细菌转座子构建适于家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统

为了较好地解决家蚕杆状病毒基因表达系统(BmNPV expression system)在重组病毒构建和纯化过程中存在的重组率低、空斑分析技术繁琐、花费时间长等缺点,借鉴国外AcNPV Bac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,对家蚕BmNPV基因组进行了改造。通过同源重组的方法,将含有单拷贝数细菌F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点、编码LacZα肽的部分DNA片段和抗性选择标记基因的基因片段重组入家蚕BmNPV基因组,替换多角体蛋白基因,获得了家蚕BmNPV病毒穿梭载体BmBacm id;并利用供体质粒上的表达盒和细菌转座子以及细菌转座子的基因定位转移作用,在细菌体内实现外源目的基因向家蚕BmNPV基因组上的转移整合,快速完成重组BmN-PV病毒的构建。

Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析(英文)

利用本实验室构建的转Ac(Ac TPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ae×Ds的杂交组合354个。检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性。结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4％。检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中。在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7％。对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制——转座和小完全切离等现象。获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录。探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略。

家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫LINE类反转录转座子R4的鉴定及系统进化分析

反转录转座子在物种基因组的进化中发挥重要作用,LINE元件属于non-LTR反转录转座子的类型之一。通过生物信息学分析方法,鉴定了一个全长3 855 bp的柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)LINE元件R4Na和一个全长3 970 bp的家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)LINE元件R4Nb。R4Na在柞蚕微孢子虫基因组中有4个呈串联排列的完整拷贝,其余拷贝序列结构和R4Nb的拷贝序列结构有很大差异,显示二者的变异程度很大,暗示2种微孢子虫比较古老。利用转录组高通量测序库比对,R4Nb反转录酶编码区插入的外源序列具有转录活性,暗示这段外源序列可能被招募为外显子。依据LINE元件的反转录酶结构域序列构建2种微孢子虫以及东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、西方蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)、按蚊微孢子虫(Anncaliia algerae)的系统进化树,结果显示R4Na和R4Nb与其它昆虫微孢子虫的R4元件具有一定相似性,而且R4元件家族在昆虫微孢子虫基因组分化过程中形成明显的3个进化群。研究结果证明家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的基因组中均存在LINE类反转录转座子,为研究2种微孢子虫的基因组结构提供了新的线索。

一种包含转座子Sleeping Beauty和PiggyBac的新型多功能载体的构建

DNA转座子作为一种遗传学工具对脊椎动物的转基因、突变体产生、癌基因发现和基因治疗方面都有巨大的贡献.目前,哺乳动物中应用最为广泛、活性最高的DNA转座子为重构于鲑鱼的Sleeping Beauty(SB)转座子和来源于甘蓝蠖度尺蛾(cabbage looper moth Trichoplusia ni)的PiggyBac(PB)转座子.本研究中,我们成功构建了包含PB和SB两种转座子的杂合转座载体,命名为PBSBD.在杂合转座载体中融入了基因捕获框及loxp/Frt元件,用以实现转座过程中的基因捕获和条件性敲除.在HepG2细胞中通过检测报告基因的表达情况及阳性克隆的定位,对构建的杂合转座载体PBSBD进行了活性的初步验证.结果表明,PBSBD能够有效被2种转座酶识别,并能检测到报告基因的表达.本研究所构建的杂合转座载体PBSBD结合2种转座酶,可以应用于大规模筛选突变基因和研究基因功能.并且该杂合转座载体还可以利用SB转座酶的邻近转座特性,结合载体内所包含的loxp/Frt元件用以邻近区域DNA片段的条件性敲除,研究大片段DNA在生物体中的作用.

家蚕LTR逆转录转座子的鉴定、分类及系统发育分析

转座子是真核生物基因组的重要组成成分。为了研究家蚕Bombyx mori长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)逆转录转座子的分类及进化,本研究采用denovo预测和同源性搜索相结合的方法,在家蚕基因组中共鉴定出了38个LTR逆转录转座子家族,序列长度占整个基因组的0.64%,远小于先前预测的11.8%,其中有6个家族为本研究的新发现。38个家族中,26个家族有表达序列标签(expression sequencetag,EST)证据,表明这些家族具有潜在的活性。对有EST证据的6个家族和没有EST证据的5个家族用RT-PCR进行了组织表达谱实验,结果表明这11个家族在一些组织中有表达,这进一步证实了这些家族具有转录活性,基于此我们推测家蚕中大部分的LTR逆转录转座子家族很可能具有潜在活性。对转座子的插入时间进行估计,结果表明绝大部分元件都是最近1百万年内插入到家蚕基因组中的。我们还比较了黑腹果蝇Drosophila melanogaster、冈比亚按蚊Anopheles gambiae和家蚕B.mori中Ty3/Gypsy超家族分支的差异,结果表明不同枝在不同昆虫中有着不同的扩张。家蚕中LTR逆转录转座子的鉴定和系统分析有助于我们理解逆转录转座子在昆虫进化中的作用。

Sleeping Beauty转座子介导敲低PEX2转基因载体的构建

目的借助Sleeping Beauty(SB)转座系统在小鼠肝脏中稳定过表达原癌基因MYC诱导小鼠肝癌形成,并在SB转座子pT3EF1α-c-Myc基础上构建可在小鼠体内敲低PEX2的重组转基因载体。方法借助水动力法尾静脉注射(Hydrodynamic tail vein injection,HTVI)和SB转座子系统向小鼠肝脏导入携带目的基因MYC的转座子质粒,诱导小鼠肝癌形成。以载体为模板,分别扩增U6-shNC、U6-shPEX2序列,通过T4连接获得目标载体pT3EF1α-c-MycshNC、pT3EF1α-c-Myc-shPEX2。结果 (1)实验组小鼠成功诱导出肝癌。(2)经酶切和测序等方法鉴定,构建质粒完全正确。(3)细胞瞬时转染实验质粒pT3EF1α-c-Myc-shPEX2及其对照质粒pT3EF1α-c-Myc-shNC,确定在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中实验组质粒可以降低PEX2的mRNA水平。结论借助HTVI技术和SB转座系统过表达c-Myc成功诱导小鼠肝癌形成,并在SB转座子质粒pT3EF1a-c-Myc基础上构建了可在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中敲低PEX2基因的重组转基因载体。

转座子突变系统在植物病理学上的应用

对复杂的生物学现象进行遗传学研究,最重要的一步是获得由基因型所决定的表型突变体。通过对此突变基因的分析,找出基因功能,从而了解现象的本质。通常使细菌产生突变体的方法有化学试剂处理和放射性辐射处理,但是这些方法有较大的局限性:随机性程度差,在一定条件下发生回复突度的可能性大(如光修复),进行定向选择的效率很低。而分子遗传学的发展提供了好的手段:用转座子突变系统特别是自杀质粒转座子系统进行研究,使定向选择更明了化和有针对性,目前它已广泛用于植物病理学研究领域。

基于piggyBac转座子系统构建长期表达人细胞因子的免疫缺陷小鼠模型

目的:探讨表达人白细胞介素6 (IL-6)、白细胞介素3 (IL-3)、白细胞介素15 (IL-15)、干细胞生长因子(SCF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的piggyBac (PB)转座子系统在免疫缺陷小鼠体内的长效表达情况,为改善人源化小鼠模型中人免疫细胞的重建提供简单长效的新方法。方法:构建含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的PB转座子质粒(PB-GFP),构建含有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因的PB转座子质粒(PB-5F)。293T细胞分为阴性对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pLVTHM质粒)、瞬时转染组(转染PB-GFP质粒)和稳定转染组[共同转染PB-GFP和转座酶质粒(super-PB)]。转染后每3d,采用流式细胞术检测各组细胞中GFP阳性(GFP+)细胞百分率。将NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NCG)小鼠分为瞬时转染组和稳定转染组,瞬时转染组小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒,稳定转染组小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒和super-PB质粒。小鼠尾静脉高压注射后1、3、5和9d及随后每周1次采血分离血清,ELISA法检测各组NCG小鼠血清中IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF水平。结果:PB-GFP转染293T细胞30d后,稳定转染组GFP+细胞百分率(4.61%±0.42%)明显高于阳性对照组(0.58%±0.05%)和瞬时转染组(0.86%±0.10%)(P<0.05)。NCG小鼠尾静脉高压注射PB-5F质粒,注射后第30天,稳定转染组小鼠血清中IL-6、IL-15和GM-CSF水平均高于瞬时转染组(P=0.048,P=0.051,P=0.045);注射后第60天,稳定转染组小鼠血清中仍能检测到IL-6、IL-15和GM-CSF。结论:体外验证了PB转座子系统的长效表达,成功构建了具有人IL-6、IL-3、IL-15、SCF和GM-CSF基因的PB转座子载体的质粒,建立了长效稳定表达人IL-6、IL-15和GM-CSF的免疫缺陷小鼠模型。

转座子及其相关技术的研究

本综述目的在于对转座子及其相关技术成果进行归纳总结．人们已经用各种方法,在生物界各个领域证实了转座子系统广泛存在．利用转座子特有的转座功能,将带有标记的转座子插入目的基因甚至基因组,产生转座子标签技术、转座子定点杂交技术、转座子基因打靶技术和非病毒栽体基因增补技术．结果,人们利用这些技术,可以确定基因组的功能,基因组间的功能差异;可以改变目的基因的活性, 获得转基因生物;可以阻断毒力基因,获得基因疫苗;可以促进基因整合,进行基因治疗等．转座子及其相关技术是后基因组时代,人们解开基因组功能之谜的强有力武器．

DNA转座子在小鼠基因功能研究中的应用

近年来,转座子介导的插入突变在哺乳动物的分子遗传学研究中得到了广泛的应用。转座子作为一种简便高效的遗传学操作工具,在构建转基因动物模型、基因治疗、细胞水平和动物整体水平的基因功能研究等方面发挥了重要的作用。文章重点介绍DNA转座子的结构、功能及其应用于小鼠分子遗传学领域的最新研究进展。

转座子Ac/Ds的水稻转化及杂交后代中Ds的跳跃分析

利用根癌农杆菌介导的转化法, 把双元表达载体CamDs(含有激活标签和基因捕获器结构)和含有玉米Ac转座酶的质粒(NeaAc)转入水稻。PCR结果表明Ac和Ds已整合到水稻的基因组中。转Ac植株与转Ds植株杂交,获得了12个杂交组合。杂交F1 代水稻苗经过抗生素筛选,得到108株同时含有Ac和Ds因子的水稻苗。Basta抗性检测了Ds因子在杂交F1 代中的跳跃情况,发现转座频率为13%。Ds空供体位点的PCR扩增结果与Basta抗性检测一致。另外,对跳动过的植株进行部分组织GUS染色表明Ds因子中的基因捕获器可以捕获到基因的表达。

马铃薯全基因组LTR反转录转座子分析

采用LTR-FINDER软件对马铃薯(Solanum tuberosum)全基因组中的LTR反转录转座子进行分析,共发现4 725个全长LTR反转录转座子,平均长度约7 393 bp,其中反转录转座子的LTR平均长度为786 bp,全长LTR反转录转座子总碱基数约占马铃薯全基因组碱基数的4.95%。系统发育分析结果显示马铃薯LTR反转录转座子具有较高的遗传多样性和异质性。

转座子Tn5096对刺孢吸水链霉菌北京变种RF220转座的诱变

用大肠杆菌／ 链霉菌穿梭质粒ｐＣＺＡ１６８（ ｂｌａ，ｔｓｒ，Ｔｎ５０９６ ，ＣｏｌＥＩｒｅｐ ，Ｓｔｒｅｐ ｒｅｐｔｓ） 多次转化农抗１２０ 产生菌刺孢吸水链霉菌北京变种（ Ｓ．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｐｉｎｏｃｕｓ ｖａｒ． ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ）ＲＦ２２０ 的原生质体，均未得到转化子。来自吸水链霉菌应城变种（ Ｓ．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ．）１０ － ２２ 突变株的链霉菌质粒ｐＩＪ７０２（ｔｓｒ ｍｅｌ＋ ） 可以转化ＲＦ２２０ ，但转化频率只有数十个转化子／μｇＤＮＡ。用来自ＲＦ２２０ 本身的ｐＩＪ７０２ 对消除ｐＩＪ７０２ 后的ＲＦ２２０ 的原生质体进行了再转化，转化率没有明显的提高。用氨苄青霉素和甘氨酸协同处理ＲＦ２２０ 的菌丝体，并经－ ７０ ℃冷冻原生质体再转化，得到了４ 个ｐＣＺＡ１６８ 的转化子。质粒提取、酶切、抗性测定表明：４ 个转化子中ｐＣＺＡ１６８ 中大肠杆菌ＤＮＡ 部分均被切除，成为大小约５０ ～６０ｋｂ的小质粒，命名为ｐ ＷＺＨ１０２（ｔｓｒ，Ｔｎ５０９６ ，ｓｔｒｅｐ ｒｅｐｔｓ） 。用ｐ ＷＺＨ１０２ 上的转座子Ｔｎ５０９６ 对ＲＦ２２０ 进行转座实验。

Tc1/Mariner转座子超家族在褶皱臂尾轮虫中的进化和表达分析

为了探究Tc1/Mariner转座子超家族对褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)基因组结构和基因表达调控的影响,本研究基于褶皱臂尾轮虫的基因组和转录组数据,对褶皱臂尾轮虫的重复序列进行了注释,并对褶皱臂尾轮虫的转座子的表达和其临近基因的表达进行了统计和富集,在基因上下游及内部区域富集到了10个转座子家族(其中3个家族属于Tc1/Mariner超家族)。在针对褶皱臂尾轮虫的Tc1/Mariner超家族分析中,共发现其7个亚家族:Tc1(DD34E)、Tc2(DD35D)、Mariner(DD34D)、Pogo(DDxD)、Sagan(DD30D)、Tigger(DD32/36D)和Fot1(DD30D),并主要分布在基因间区,对转座酶催化区域的结构和系统发育分析显示拥有完整转座酶的3个亚家族(Tc1、Tc2和Pogo)保守性强且聚类情况良好。基于转录组数据发现各个家族的表达模式较为相似,在雄性阶段表达较高。Tc1/Mariner超家族临近基因的功能大量涉及到环境信息处理和生物发育调节,反映了褶皱臂尾轮虫基因组对环境的适应。本研究通过对褶皱臂尾轮虫Tc1/Mariner转座子超家族在基因组中的进化和表达进行系统分析,为从功能角度认知Tc1/Mariner转座子并理解Tc1/Mariner对基因组进化的作用提供了新的线索。

Sleeping Beauty转座酶转基因小鼠模型的建立

目的建立表达Sleeping Beauty(SB)转座酶转基因小鼠模型,为研究SB转座子在小鼠中的应用提供工具动物。方法利用人的泛素C启动子驱动SB转座酶基因的表达,利用显微注射方法建立C57BL/6J表达SB转座酶的转基因小鼠。PCR鉴定首建鼠的基因型,Western Blot(WB)和免疫组织化学(IHC)检测SB转座酶基因在小鼠生殖腺睾丸中的表达情况,筛选睾丸中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结果通过显微注射方式产生了4只首建小鼠,其中3只能稳定传代,利用WB和IHC成功的筛选出一株在睾丸中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结论成功建立了睾丸组织中高表达SB转座酶转基因小鼠动物模型,为将SB转座子应用于建立基因修饰小鼠模型提供非常重要的工具动物。

piggyBac转座系统的发展及应用

转座子是指在原核和真核生物基因组上可以进行位置转换的DNA片段。转座子通过在原始位置上进行剪切或复制,经环化作用在转座酶辅助下插入到宿主基因组的其他位置,转座子发生位置转移的过程即为转座。转座子可以在基因组任意插入和切除,常用于哺乳动物细胞基因编辑的研究之中。相较于病毒介导的转染和传统转座子系统,piggy Bac（PB）转座子拥有多种优点,广泛应用于转基因及功能基因研究中。

短散在元件的筛选方法及其在鲸类和爬行类系统发育与进化研究中的应用

短散在元件(short interspersed repetitive elements,SINEs)是广泛分布于真核生物基因组中的一种反转录转座子。近年来越来越多的研究表明SINEs对基因组的结构、功能和进化起着重要作用,是研究物种系统发育和种群生物学的一个良好分子标记。本文简单介绍了SINEs的特征、基本结构、分离和鉴定,以及近年来SINEs标记在系统发育与进化研究中的应用。