组蛋白去乙酰化酶抑制剂Belinostat对髓源性树突状细胞免疫功能的作用研究

目的探讨组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂Belinostat对小鼠骨髓来源树突状细胞（DC）免疫功能的影响及初步机制。方法体外诱导培养C57BL／6小鼠骨髓来源的DC，诱导培养第5天为未成熟DC（imDC）组，设0、50、100nmol／LBelinostat作用组；imDC以脂多糖作用24h为成熟DC（mDC），设0、50、100nmol／LBelinostat作用组。从细胞形态、超微结构、免疫表型进行鉴定。流式细胞术检测各组DC免疫表型及趋化因子受体CCR7表达水平，趋化实验检测DC的体外迁移率。单向混合淋巴细胞培养法检测各组DC刺激下异基因淋巴细胞增殖率。ELISA法检测各组DC培养上清中TNF—α、IL-12及IL-10的表达水平。RQ—PCR检测Belinostat对DC中RelBmRNA表达水平的影响。结果成功诱导培养出imDC及mDC并鉴定。50和100nmol／LBelinostat＋imDC组CCR7表达水平均低于imDc组[（25．82±7．25）％对（50．44±5．61）％、（18．71±2．00）％对（50．44±5．61）％j；50nmol／LBelinostat＋mDC组CCR7表达水平高于mDC组[（71．14±1．96）％对（64．90±1．47）％]。Belinostat作用下imDC和mDC的迁移率均下降，但在imDC中组间比较差异无统计学意义。当刺激细胞：反应细胞比例为1：2时，100nmol／LBelinostat＋imDC刺激下淋巴细胞增殖率低于imDC组[（227．09±13．49）％对（309．49±53．69）％]。Belinostat作用下mDC所分泌的TNF-α、IL-12和IL-10较mDC组均明显下降，差异均有统计学意义（P值均〈0．01）。Belinostat＋imDC及Belinostat＋mDC中RelBmRNA表达水平较imDC组及mDC组均有降低（P值均〈0．05）。结论Belinostat可调节DC迁移、抑制T淋巴细胞增殖及细胞因子分泌，一定程度上抑制DC成熟，可能与其下调DC中NF—kB的转录因子RelBmRNA水平有关。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂贝利司它的合成工艺研究

以磺胺基苯基取代的丙烯酸乙酯为原料,氢氧化钠为碱和催化剂,盐酸羟胺为试剂,通过官能团转化反应,合成了T细胞淋巴瘤的化疗用药贝利司它。采用红外光谱、紫外可见光谱、核磁共振氢谱、质谱、元素分析和熔点测定等技术对产物结构进行了表征。通过单因素变量法探讨了反应物料比、反应温度、碱用量和反应时间对产物产率的影响,得出该反应的最佳工艺条件为:当物料配比n盐酸羟胺:n原料=35∶1,碱的用量为0.11mol(当n原料=6.7mmol时),反应温度为0℃,反应时间为60min时,产物贝利司它纯化后产率可达到70%。

HPLC法测定贝林司他中有关物质的含量

目的:建立贝林司他中有关物质的含量测定方法。方法:采用高效液相色谱法检测并以加校正因子的主成分自身对照法进行计算。以ODS-AM为色谱柱,以1.02%磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH值至3.5)-乙腈(85∶15,V/V)为流动相A、1.02%磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH值至3.5)-乙腈(30∶70,V/V)为流动相B进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温为30℃,检测波长为220 nm,进样量为10μL。结果:贝林司他及杂质A、D、F、G、H的线性范围分别为0.113~1.693、0.050~1.496、0.117~1.750、0.098~1.471、0.120~1.799、0.100~1.506μg/mL(r≥0.9997),后5个杂质的校正因子分别为1.0、1.0、1.2、1.5、1.0;检测限分别为0.250、0.590、0.490、0.600、0.500 ng,定量限分别为0.500、1.170、0.980、1.200、1.000 ng,回收率为90.18%~111.48%(RSD为1.52%~4.78%,n=9),稳定性(100 h)、精密度试验的RSD均不大于16%,耐用性良好。3批贝林司他原料药中检测出杂质A、D、H,含量分别为0.030%~0.038%、0.019%~0.022%、0.012%~0.013%,其他最大单体杂质含量为0.012%~0.013%,总杂质含量为0.075%~0.084%,未检出杂质B、C、F、G。结论:成功建立了测定贝林司他中有关物质含量的方法,且方法准确、专属性好。

贝利司他抑制骨肉瘤细胞活力的分子机制

目的:观察组蛋白脱乙酰酶抑制剂贝利司他对骨肉瘤细胞活力的影响,并初步研究其作用机制。方法:用不同浓度的贝利司他处理体外培养的骨肉瘤细胞系SAOS-2和U2OS后,采用MTT法检测细胞的活力,荧光探针和ELISA分别检测caspase-3/-7的酶活性以及DNA片段化以观察贝利司他对骨肉瘤细胞凋亡的影响,并采用Western blot检测组蛋白乙酰化水平、caspase-3、Bcl-xL和PTEN的表达,以及Akt和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的磷酸化水平。用不同浓度的贝利司他和多柔比星(又称阿霉素)共同孵育U2OS和SAOS-2细胞,MTT观察其对细胞活力的影响,并计算其联合指数(CI)。结果:0.5、1、2.5和5μmol/L贝利司他处理U2OS和SAOS-2细胞48 h后,均可呈剂量依赖性方式抑制其活力,诱导DNA片段化,增强caspase-3/-7的活性,上调cleaved caspase-3水平,减少Bcl-xL的表达,促进细胞内组蛋白H3和H4乙酰化。Western blot结果显示,贝利司他处理后,U2OS和SAOS-2细胞中磷酸化Akt和GSK-3β水平显著降低(P<0.01)。MTT结果显示,贝利司他和阿霉素联合作用后,可进一步降低细胞的活力,两者之间具有协同作用(CI<1)。结论:贝利司他能协同阿霉素抑制骨肉瘤细胞活力,其机制可能与抑制Akt信号通路有关。

贝利司他药物专利分析

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂作为一种新型抗肿瘤药物,尤其是针对外周T细胞淋巴瘤(PTCL)的治疗研究愈发成为热点。本文针对HDAC抑制剂的代表性药物贝利司他,对其相关专利申请状态进行了分析,比较了贝利司他国内、国外专利申请在申请量趋势、技术来源国分布、申请人/专利权人分布、技术主题分布上的差别以及国外、国内、来华申请之间的质量差距,厘清了贝利司他专利技术发展脉络,梳理了原研企业的专利布局,以期为国内仿制药企业制定合理研发策略,进行有效专利布局提供参考和依据。

贝利司他的合成

本研究设计以下路线合成贝利司他。采用"一锅法"先使3-溴苯磺酰氯与苯胺反应得3-溴-N-苯基苯磺酰胺,然后不经纯化直接与丙烯酸乙酯经Heck偶联得(E)-3-[3-(N-苯胺基磺酰基)苯基]丙烯酸乙酯。最后在氢氧化钠作用下与羟胺反应得贝利司他,总收率62%,纯度99.1%。本工艺路线短、收率高、操作简捷,已经公斤级中试验证。