牛奶中活沙门氏菌BCAC-EMA-Rti-LAMP快速检测方法的研究

研究以沙门氏菌的invA基因序列设计特异性引物,结合蒙脱石封闭的活性炭(BCAC)吸附、叠氮溴化乙锭(EMA)前处理牛奶样品,建立了一种基于实时荧光环介导等温扩增法(Rti-LAMP)非预增菌快速检测牛奶中低浓度活沙门氏菌的方法。以每份25 mL牛奶样品,人工模拟不同浓度沙门氏菌污染,用4.0 g蒙脱石封闭的活性炭吸附处理样品,然后对回收精制的细菌样品用4.0μg/mL EMA终浓度作用处理,提取细菌样品DNA用于RtiLAMP扩增检测,该方法检测灵敏度为1×10^1CFU/mL活沙门氏菌,整个检测过程约5 h。以沙门氏菌国标检测法为参照,采用BCAC-EMA-Rti-LAMP检测生鲜牛奶样品27份,结果显示:2种方法均检测到同一份沙门氏菌阳性牛奶样品,而BCAC-EMA-Rti-LAMP另检测到3份牛奶样品沙门氏菌阳性。研究表明,建立的BCAC-EMARti-LAMP检测方法较国标检测法更灵敏、快速,可用于牛奶沙门氏菌污染的快速检测。

基于实时荧光环介导等温扩增快速检测鸡肉中的大肠杆菌O157:H

以大肠杆菌O157:H7的VT2基因序列设计特异性引物,利用Midori Green新型核酸荧光染料,建立鸡肉中大肠杆菌O157:H7实时荧光定量环介导等温扩增(Rti-LAMP)检测方法。纯培养大肠杆菌O157:H7检测灵敏度达3.5 CFU/反应,需时45 min。模拟大肠杆菌O157:H7污染鸡肉样品,经37℃增菌4 h,用Whirl-pak无菌袋过滤离心得沉淀,提取样品DNA模板用于Rti-LAMP反应,检测大肠杆菌O157:H7灵敏度达140 CFU/g,整个检测流程约7 h。采用蒙脱石封闭的活性炭前处理污染鸡肉样品,不经增菌过程,结果表明:该Rti-LAMP检测方法灵敏度达12 CFU/g,整个检测耗时约4.5 h。市购鸡肉样品51份,以大肠杆菌国标检测法为对照,研究基于Rti-LAMP联合增菌或封闭活性炭预处理而不经增菌的两种方法,对比检测临床鸡肉样品大肠杆菌O157:H7污染率。结果:国标法和增菌的Rti-LAMP两种方法均检测到同一鸡肉样品为大肠杆菌O157:H7阳性,经封闭活性炭预处理而未经增菌的Rti-LAMP则检测到8份鸡肉样品大肠杆菌O157:H7阳性。研究表明,封闭活性炭预处理的Rti-LAMP检测方法较国标法更灵敏、快速、简便、特异地检测鸡肉中大肠杆菌O157:H7污染。

牡蛎中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法的建立

目的建立一种无需前增菌快速检测牡蛎中单核细胞增生李斯特菌的PCR方法。方法利用β-环糊精和膨润土包被活性炭处理牡蛎样品,去除聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)反应抑制因子,以单核细胞增生李斯特菌特异基因inlB为靶基因,建立无需样品前增菌的PCR快速检测方法。同时验证该方法的特异性、灵敏度及实用性参数,并评估该方法所用试剂在冷冻保存后的稳定性与实用性。结果建立的PCR方法对130株目标菌和63株非目标菌的检测特异性为100%,灵敏度达10 CFU/25 g。该方法无需前增菌,4 h即可完成检测。PCR方法和国标方法对实际样品中单核细胞增生李斯特菌的检出率(均为13%)和活菌检测率(均为100%)一致,即符合率100%。此外,该方法所用试剂在-20℃冷冻条件下可稳定保存至少1年。结论建立的PCR方法特异性强、灵敏度高,可快速、准确检测出牡蛎中的单核细胞增生李斯特菌。