C型产气荚膜梭菌β毒素基因克隆与核苷酸序列分析

用ＰＣＲ技术，从含Ｃ型产气荚膜梭菌β毒素基因质粒ｐＢ１２中扩增出了０．９５Ｋｂ的β毒素基因，然后用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对其进行双酶切处理，最后将其定向连接在事先经同样内切酶处理的载体ｐＥＴ－２８ｃ（＋）中的相应位点上，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＢ２含有产气荚膜梭菌β毒素基因，确定了其全部的核苷酸序列。

表达CPB-ST融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达产气荚膜梭菌β毒素（ＣＰＢ）和大肠埃希氏菌ＳＴ融合蛋白（ＣＰＢＳＴ）的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＥＣＢＳＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌株中提取的包涵体和经甲醛灭活的工程菌株全菌体制备抗原免疫小白鼠，攻毒试验结果表明，免疫小白鼠能分别抵抗１ＭＬＤ的Ｂ型产气荚膜梭菌强毒株（Ｃ５８－１）和产ＳＴ的大肠埃希氏菌工程菌株ＨＢ１０１（ｐＳＬＭ００４）的攻击。用灭活的全菌体免疫家兔后，其免疫血清能中和产气荚膜梭菌β毒素和大肠埃希氏菌ＳＴ的毒素活性。结果表明，构建的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＥＣＢＳＴ１）可以作为预防由产气荚膜梭菌β毒素和大肠埃希氏菌ＳＴ引起的幼畜腹泻的基因工程苗侯选菌株。

表达产气荚膜梭菌α-β融合蛋白基因工程菌株的构建

用 PCR从含产气荚膜梭菌 α毒素基因的质粒 p XETA1中扩增出 α毒素基因 ,用 Nco I和 Bam HI双酶切该α毒素基因 ,回收 0 .95 kb的α毒素基因片段 ,再用 Nco I和 Bam HI双酶切含产气荚膜梭菌 β毒素基因质粒 p XETB2 ,与上述回收的 α毒素基因片段连接 ,转化至受体菌 BL2 1( DE3)中。经 Nco I、Bam HI、Not I酶切反应鉴定和核苷酸序列分析证实 ,获得了理想重组质粒p XCPAB2 ,该重组质粒含有α-β融合基因。重组菌株 BL 2 1 ( DE3) ( p XCPAB2 )经 IPTG诱导后 ,其表达产物经 ELISA检测和 SDS- PAGE分析 ,结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合蛋白 ,该融合蛋白占菌体总蛋白的 2 2 .1 4%。用从 IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠 ,免疫小鼠至少能抵抗 2 MLD的 C型产气荚膜梭菌的攻击。这表明构建的工程菌株 BL2 1 ( DE3) ( p XCPAB2 )

产气荚膜梭菌α-β融合基因的构建

用 PCR从含产气荚膜梭菌β毒素基因的质粒 p XETB2中扩增出β毒素基因 ,Nco 和 Bam H 双酶切该 β毒素基因 ,回收 0 .93kb的 β毒素基因片段 ,再用 Nco 和 Bam H 双酶切含产气荚膜梭菌 α毒素基因质粒 p XETA1 ,与上述回收的 β毒素基因片段连接 ,转化至受体菌 BL2 1 ( DE3)中。经 Nco 、Bam H 、Not 酶切反应鉴定和核苷酸序列分析证实 ,获得的重组质粒 p XCPAB1含有 α-β融合基因。重组菌株 BL2 1( DE3) ( p XCPAB1 )表达产物经 ELISA检测和 SDS-PAGE分析 。

产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法。【方法】将原核表达重组质粒pET-28a-β转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行Western blot鉴定。用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA试验条件,建立其抗体间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行考察,并用其对521份临床样本进行检测。【结果】通过诱导、纯化和复性,获得了纯度较高且具有良好反应原性的β毒素重组蛋白。间接ELISA条件为：抗原最佳包被质量浓度为5.0μg/mL,阳/阴性血清最佳稀释度为1∶50,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 500,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃封闭1h,抗原抗体作用1h,TMB显色30min。间接ELISA的判定标准为OD450≥0.313为阳性,OD450〈0.313为阴性;建立的间接ELISA方法的特异性为96%,敏感性为98%;批内变异系数在3%-4%,批间变异系数在9%以下。利用间接ELISA检测方法对521份临床山羊血清样本的检测结果表明,抗体阳性率为72.5%。【结论】对产气荚膜梭菌β毒素进行了原核表达,成功建立了其抗体间接ELISA检测方法,为产气荚膜梭菌β毒素抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。

四种靶向因子与柯萨奇病毒B3 VP1融合基因疫苗免疫效果的比较

目的:比较巨噬细胞源趋化因子(MDC)、补体片段C3d3、志贺毒素B亚单位(STxB)和小鼠β-防御素2(mBD2)分别与柯萨奇病毒B3(CVB3)VP1构建的融合基因疫苗及VP1基因疫苗对小鼠的免疫效果。方法:将雄性BALB/c小鼠随机分为6组,每组22只,分别于股四头肌注射pcDNA3、pcDNA3/VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1-C3d3、pcD-NA3/STxB-VP1和pcDNA3/mBD2-VP1,接种剂量为每次100μg/只,3周免疫1次,共3次。每次免疫后第14天内眦静脉取血,用微量中和试验滴定血清中和抗体滴度。第3次免疫后第21天,每组随机取3只小鼠,制备脾淋巴细胞,用CCK-8细胞计数法检测特异性CTL的杀伤活性;每组取3只小鼠以3LDLD50CVB3病毒攻击,第7天取血处死,检测血清病毒滴度;其余小鼠以5LDLD50的CVB3攻击,观察各组的生存情况。结果:除了pcDNA3对照组,其他各组的中和抗体滴度均随免疫次数的增加而提高(P<0.01),第3次免疫后,pcD-NA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1-C3d3和pcDNA3/mBD2-VP1组的抗体滴度明显高于pcDNA3/VP1组(P<0.01);pcDNA3/STxB-VP1和pcDNA3/mBD2-VP1组CTL杀伤活性显著高于其他各组(P<0.01)。致死量病毒攻击后,pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1-C3d3和pcDNA3/mBD2-VP1组小鼠血中病毒滴度显著低于其他组(P<0.01);pcDNA3/MDC-VP1和pcD-NA3/VP1-C3d3组小鼠生存率显著高于其他各组(P<0.05)。结论:pcDNA3/MDC-VP1和pcDNA3/VP1-C3d3能诱导出较强的体液免疫和细胞免疫,能有效降低血中病毒滴度,获得较高的小鼠生存率;整体效果优于其他组。

C型产气荚膜梭菌致病机理研究进展

C型产气荚膜梭菌能够引起人类和一些动物的坏死性肠炎。该菌能产生α外毒素和β外毒素,大部分该菌菌株也能分泌出产气梭菌细胞溶素O(PFO)和TpeL。试验证明β外毒素是C型产气荚膜梭菌的主要致病毒素。在兔子肠襻和小鼠模型试验中发现,通过细胞中同源基因C型产气荚膜梭菌β毒素敲除基因突变株而导致该菌株失去毒力。当野生型β毒素基因补充这些突变体时毒素的活力将会复活。大多数C型产气荚膜梭菌产生的所有毒素(除TpeL外)都易与肠癌(Caco-2)细胞紧密结合并发生反应,比它在体外生长更加迅速。VirS/virR双组分调节系统(TCRS)被证明是在Coca-2细胞中导致β毒素和PFO产生快速上调。当virR基因被抑制时,pfoA和β毒素基因的表达也会受阻,这种系统是可逆的,virR表达时会恢复。通过β毒素作用于动物模型的试验研究,来寻找有效的预防措施。

A型肉毒毒素对增生性瘢痕影响的研究进展

增生性瘢痕是纤维结缔组织过度增生性疾病,突出于皮肤表面,临床表现为畸形、功能障碍、疼痛和瘙痒等,治疗方法有手术、激素、放射治疗、激光及压力疗法等,目前尚无有效的方法。近年陆续有不同学者研究发现A型肉毒毒素能够预防和治疗增生性瘢痕,该文通过综述近年来A型肉毒毒素与增生性瘢痕关系的研究进展,简要总结A型肉毒毒素与细胞因子、皮肤张力之间的关系。

产气荚膜梭菌β毒素蛋白抗原表位预测及CPB-N蛋白免疫原性分析

为获得具有与β毒素蛋白相同免疫原性的新蛋白,本研究对产气荚膜梭菌β毒素蛋白的氨基酸序列进行综合分析,预测其抗原表位并筛选出有效的新蛋白。采用生物信息学方法综合分析β毒素蛋白二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、跨膜区域以及信号肽,同时参考ElliPro服务器在线预测。最终预测aa108～aa320区段为优势抗原表位,在此基础上建立β毒素蛋白三维结构模型,标记特殊位点并筛选出B型产气荚膜梭菌新蛋白(CPB-N)。诱导表达CPB-N后通过SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示在约24 ku处有明显条带。采用间接ELISA方法对免疫小鼠的血清和肠道灌洗液样品进行检测,结果表明CPB-N与β毒素蛋白的免疫原性基本相同。CPB-N蛋白的筛选及预防产气荚膜梭菌引起的疾病奠定了重要的研究基础。

OEPR法构建含不同破伤风毒素T细胞表位的CPB表达质粒及其产物的初步鉴定

为了提高产气荚膜梭菌β毒素(CPB)亚单位疫苗的免疫效果,试验将不同破伤风毒素辅助性T细胞表位引入该蛋白前,用OEPR(Overlap Extension PCR and Recombination)法构建了8个重组表达质粒(即p Cold-CPB、p Cold-P2-CPB、p Cold-P21-P30-P2-CPB、p Cold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB和p ET22b-CPB、p ET22b-P2-CPB、p ET22b-P21-P30-P2-CPB、p ET22bP32-P23-P21-P30-P2-CPB)。将阳性重组质粒转入到大肠杆菌中,以自诱导培养基表达目的蛋白。SDS-PAGE分析结果表明,8个重组菌均成功表达出目的蛋白,且大小均与预期一致。Western Blotting检测结果表明,重组蛋白均可被C型产气荚膜梭菌阳性血清识别。毒性试验结果表明,重组蛋白均可致死小鼠。本研究首次用OEPR法成功构建了8个含不同破伤风毒素T细胞表位的产气荚膜梭菌β毒素表达质粒,并成功表达了目的蛋白,为探索破伤风毒素辅助性T细胞表位对产气荚膜梭菌β毒素免疫效果的影响及进一步开发亚单位疫苗奠定了基础。

抗β淀粉样蛋白单克隆抗体绕过血脑屏障进入小鼠大脑海马区有效途径的研究

目的利用霍乱毒素B亚单位(CB)的嗅神经细胞轴浆转运载体功能,将其与抗β淀粉样蛋白(Aβ)单抗偶联,绕过血脑屏障进入小鼠大脑海马部位的效率及改善情况,为老年性痴呆的免疫治疗探索更有效途径。方法以抗Aβ单抗杂交瘤细胞株制备抗Aβ单抗(IgG),纯化后用过碘酸钠法将其与CB偶联(CB-IgG),选择31只小鼠经鼻腔给药,分为CB-IgG组、IgG组、CB组、生理盐水组,分别以3次实验完成。采用Western blot、免疫组织化学及MRI方法检测单抗进入小鼠大脑部位的量及效率,并进行比较。结果 CB-IgG组有60%的IgG进入大脑中,IgG组有12%进入大脑,CB-IgG组较IgG组效率高5倍。IgG主要进入齿状回的颗粒细胞和CA1区的椎体细胞,在齿状回CB-IgG组阳性细胞为IgG组的5倍,在CA1区CB-IgG组阳性细胞为IgG组的3倍(P<0.05,P<0.01)。弥散张量成像分析显示,CB-IgG小鼠给药前后表观弥散系数变化较IgG明显(P<0.01)。结论 CB-IgG偶联物鼻腔给药可以绕过血脑屏障将更多抗Aβ单抗进入脑内海马部位,其效率比单用IgG提高了5倍。

霍乱毒素B亚单位增强抗原效应抑制痴呆鼠病变形成的研究

目的探讨黏膜佐剂霍乱毒素B亚单位(CB)对β淀粉样多肽(Aβ)抗原效应的增强作用及对脑中Aβ斑块形成的抑制作用。方法选取转基因阳性痴呆模型鼠24只,至7月龄时,随机分为Aβ+CB组、Aβ+铝佐剂(AL)组、单Aβ抗原组、阳性对照组,每组6只,另6只转基因阴性鼠作为阴性对照组。鼻腔滴入佐剂,1次/周,持续5个月,间接ELISA法测血清抗体效价,Morris水迷宫实验测小鼠的行为学能力,双抗夹心ELISA法测脑中Aβ含量,免疫组织化学染色观察脑中Aβ斑块形成。结果免疫5个月后,Aβ+CB组抗体效价最高,为14 000,Aβ+AL组为12 000。与阳性对照组比较,Aβ+CB组寻找隐性平台时间缩短约50%(P<0.05),Aβ+AL组变化不明显(P>0.05);Aβ+CB组脑中Aβ含量明显减少(P<0.05),Aβ+AL组略有降低(P>0.05);Aβ+CB组海马区、皮质区Aβ斑块分别减少56.4%、45.6%(P<0.05),Aβ+AL组斑块减少不明显(P>0.05)。结论黏膜佐剂CB增强Aβ抗原的效应、抑制痴呆鼠脑中Aβ斑块形成,改善小鼠学习记忆能力的作用较LA更明显。

PCR-变性高效液相色谱技术检测食品中产气荚膜梭菌

目的:进行PCR结合DHPLC技术,快速检测食品中污染的产气荚膜梭菌的新方法研究。方法:采用DHPLC技术检测产气荚膜梭菌特异性PCR扩增产物,优化分析条件,并探讨其灵敏度、特异性和精密度。结果:建立产气荚膜梭菌PCR-DHPLC样品吸收特征峰型图,样本检测的峰型图可用于定性或定量监测食品中产气荚膜梭菌的动态变化。结论:研究结果表明,所建立的食品中产气荚膜梭菌PCR-DHPLC方法具有特异性强、灵敏度高、快速等优点。

牦牛源C型产气荚膜梭菌动物致病性及其β毒素基因生物信息分析

复苏培养本实验室保存的牦牛源C型产气荚膜梭菌Qinghai-06(GenBank登录号:MW980095),利用振荡比浊法、动物试验和病理切片方法对菌株生长曲线及动物致病性进行研究,随后通过对β毒素基因扩增、克隆、双向高通量测序、生物软件分析等分子生物学与生物信息学方法对其编码蛋白的一级结构、二级结构、三级结构、蛋白特殊区域及B细胞线性抗原表位进行分析。结果显示,牦牛源C型产气荚膜梭菌Qinghai-06菌株按照5%体积分数接种后,2~6h为对数期;菌液D_(600 nm)值与稀释倍数的关系式为y=-0.857ln(x)+2.236;菌液D_(600 nm)值与菌落CFU的关系式为:y=0.881x-0.017;菌株对感染小鼠的LD_(50)为0.408×10^(8)CFU/m L。H.E染色镜检观察到可引起肠、脑、肾脏、肝脏、脾脏组织病理变化。β毒素基因序列长927bp,共编码309个氨基酸,分子式为C_(1535)H_(2396)N_(406)O_(502)S_(9),相对分子质量为34.9ku,p I=5.52,不稳定指数为35.91,亲水性总平均值为-0.567,含有全部20种氨基酸,为单体,含1个Zn^(2+)配体。结果表明:牦牛源C型产气荚膜梭菌Qinghai-06属强致病菌株,其β毒素蛋白为含丰富无规则卷曲结构和潜在磷酸化位点的、稳定的亲水性蛋白,有效B细胞线性抗原表位主要集中于140~290区段。

生脉散对大肠杆菌脂多糖诱导慢性肝衰竭大鼠细胞因子水平的影响

目的探讨生脉散对慢性肝衰竭大鼠大肠杆菌脂多糖（LPS）诱导细胞因子水平的影响。方法采用CCl。混合液腹腔注射复制慢性肝衰竭大鼠模型，观察LPS诱导2h后生脉散后对血清内毒素、细胞因子水平的影响。结果CCl。混合液能明显增加大鼠血清IL-6[（64．50±18．79）pg／mlVS（4．79±0．57）pg／m1]、ICAM-1[（25100．00±5258．85）pg／mlVS（4215．50±942．79）pg／m1]和TNF-α[（17．55±2．39）pg／mlVS（10．92±5．02）pg／m1]水平（P〈0．05），但对血清LPS水平无明显影响[（0．058±0．007）EU／mlVS（0．040±0．002）EU／ml，P〉0．05]；中药生脉散能显著降低CCl。慢性肝衰竭大鼠血清IL-6、ICAM-1和TNF-α水平[分别为（17．20±3．12）pg／ml、（9490．00±2725．78）pg／ml、（3．00±1．00）pg／ml，P〈0．05]。LPS攻击2h后能明显升高CCI。混合液大鼠血清LPS、TNF-α、IL-6、ICAM-1水平[分别为（0．501±0．019）EU／ml、（19750．00±9655．17）pg／ml、（5615．00±490．50）pg／ml、（41000．00±589．88）pg／ml，P〈0．01]。结论在慢性肝衰竭模型中，LPS能增加TNF-α，IL-6和ICAM-1等炎症因子水平，中药生脉散可降低LPS水平，并抑制LPS诱导的炎症因子水平，阻断了炎性介质及LPS本身对机体的损伤。