NF-κB在抗β_2GPⅠ/β_2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达组织因子中的作用探讨

目的:探讨核因子κB(NF-κB)在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:使用一定剂量的抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物处理THP-1细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞TF mRNA水平,TF活性试剂盒检测TF活性;Western blot检测细胞NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65及NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达情况;进一步采用NF-κB抑制剂(PDTC)观察是否能干预抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应,并利用上游信号分子MAPKs的抑制剂观察抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对NF-κB p65磷酸化的影响。结果:抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)能够诱导THP-1细胞表达TF mRNA及活性,与对照相比差异显著(P<0.05);能够增强细胞内NF-κB p65磷酸化(P<0.05 vs media),降低IκB-α水平(P<0.05 vs media);NF-κB抑制剂PDTC(20μmol/L)能够抑制抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞表达TF及NF-κB磷酸化的效应;MAPKs抑制剂均能影响抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞NF-κB p65磷酸化。结论:在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中,NF-κB被激活并发挥重要作用,MAPKs为NF-κB的关键上游分子。

Toll样受体4在抗β_2GPⅠ-β_2GPⅠ复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达炎症因子中的作用

目的观察抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物刺激小鼠腹腔巨噬细胞表达TNF-α、IL-1β、IL-6的效果,探讨Toll样受体4(TLR4)在其中的作用。方法对C3H/He N(TLR4正常)小鼠、C3H/He J(TLR4缺陷)小鼠腹腔注射非特异性兔Ig G(R-Ig G)、抗β2GPⅠ抗体,72 h后用细胞免疫荧光法检测小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平;抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物对小鼠腹腔巨噬细胞进行体外刺激,荧光定量PCR法检测细胞表达上述因子的mRNA水平,western blot法检测其蛋白质分泌水平。结果抗β2GPⅠ抗体刺激的C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6的水平明显高于C3H/He J小鼠,并经细胞免疫荧光法验证;经体外刺激后,荧光定量PCR法结果显示抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物诱导C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平高于空白组或C3H/He J刺激组(P均<0.01);western blot结果显示C3H/He N来源细胞TNF-α、IL-1β、IL-6分泌均显著高于C3H/He J来源细胞(P均<0.01)。结论抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物能够促进小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,TLR4为介导此过程的受体之一。

oxLDL/β_2GPⅠ复合物与自身免疫背景下AS的关系

在动脉粥样硬化发展过程中,动脉内膜上形成的oxLDL/β2GPⅠ复合物可以释放到循环血液中。在SLE、APS等自身免疫疾病中,可以检测到抗oxLDL/β2GPⅠ复合物的自身抗体,与动脉血栓的形成有高度相关性。本文就自身免疫疾病背景下,对oxLDL/β2GPⅠ复合物的存在、生物学功能及其与动脉粥样硬化关系的研究进展进行综述。

抗β_2GPⅠ抗体/β_2GPⅠ与PLT活化

近年来，血栓性疾病发病率不断上升，严重威胁人类健康和生命，血小板（PLT）活化是血栓形成的始动因素，在血栓形成中起到关键作用。研究发现抗β2糖蛋白Ⅰ（β2GPI）抗体出现在多种血栓性疾病中，常见于抗磷脂综合征，能使体内PLT活化并和纤维蛋白结合，引起PLT聚集，

hβ_2GPⅠ第一功能区基因单体和二串联体的克隆和表达

目的:构建h2βGPⅠ(h2βGPI)第一功能区基因单体及二串联体的原核表达载体PQE30-β2GP-ⅠDI和PQE30-β2GPⅠ-DI2,并在大肠杆菌M15中进行高效表达。方法:应用PCR技术扩增hβ2GPⅠ第一功能区基因的单体β2GPⅠ-DI,并根据同尾酶特性构建hβ2GPⅠ第一功能区基因二串联体β2GPⅠ-DI2,将获得的单体和二串联体分别与PGEM-T easy载体连接测序,测序正确后分别克隆于原核表达载体PQE30中,构建成重组表达载体PQE30-β2GPⅠ-DI和PQE30-β2GPⅠ-DI2,在大肠杆菌M15中以l mmol.L-1IPTG诱导蛋白表达,经Western blotting鉴定目的蛋白的抗原性。结果:表达了hβ2GPⅠ第一功能区基因的单体及二串联体的蛋白,相对分子质量约为9 000和17 000,其表达量均可达菌体总蛋白的25%,并具有hβ2GPⅠ的抗原性。结论:成功构建了hβ2GPⅠ第一功能区基因的单体及二串联体的原核表达载体,并诱导了蛋白的高效表达。

TLR4在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF中的作用探讨

目的:探讨TLR4及相关信号分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:利用荧光定量PCR(Real-timePCR)检测anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导THP-1细胞TFmRNA表达,采用试剂盒检测细胞TF活性;利用自制的β2GPⅠ胶联亲和层析柱(β2GPⅠ-Affi-Gel)分析β2GPⅠ与THP-1细胞表面相应受体结合情况;Real-timePCR及Western蛋白印迹检测anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导细胞表达TLR4、MyD88、MD-2情况;观察TLR4途径抑制物——紫杉醇是否干预anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的作用。结果:Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞TF表达显著增加(P<0.05);THP-1细胞表面的TLR4能够结合于β2GPⅠ-Affi-Gel柱;Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)刺激THP-1细胞表达TLR4、MyD88、MD-2显著升高(P<0.05);紫杉醇(1μmol/L)能够抑制anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应。结论:TLR4及相关信号分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF中具有重要作用。

β_2糖蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)单克隆抗体(MAbs),并鉴定抗体的特性。方法:以纯化的人血浆β2GPⅠ免疫BALB/c小鼠,采用PEG融合技术,间接ELISA法和有限稀释法,制备和筛选杂交瘤细胞。杂交瘤细胞继续扩大培养后注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水,经硫酸铵沉淀及Protein G纯化MAbs。秋水仙素阻抑法鉴定杂交瘤细胞株染色体数目,ELISA测定滴度,Ig亚类试剂盒鉴定Ig亚类,Western blot鉴定特异性。结果:获得1株稳定分泌MAbs的杂交瘤细胞株β2,该杂交瘤细胞株的染色体数为99～108。进一步研究发现,其培养液和腹水滴度为1∶29和1∶215,其MAbs分类为IgG1/κ,Western blot显示纯化的MAbs及标准anti-β2GPⅠ与β2GPⅠ均有反应条带,具有较好的特异性。结论:成功获得并纯化β2GPⅠ单克隆抗体,为进一步研究β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ复合物在抗磷脂综合征中的作用奠定了基础。

oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物调节A7r5表型转化及脂质转运分子表达

目的探讨氧化型低密度脂蛋白/β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ抗体复合物(oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab complex)对大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A7r5)表型转化和细胞表面脂质转运分子的影响,以及toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)信号通路在其中的作用。方法分别用oxLDL、oxLDL/β2GPⅠ复合物、oxLDL/抗β2GPⅠ抗体复合物、β2GPⅠ/抗β2GPⅠ抗体复合物、oxLDL/β2GPⅠ/抗β2GPⅠ抗体复合物刺激A7r5,收集总RNA和蛋白质,利用实时定量PCR、western blot及免疫荧光染色等方法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、巨噬细胞表面标志CD68、半乳糖凝集素3(galectin-3,LGALS3)、B类清道夫受体3(CD36)和ATP结合盒转运体(ATP-binding cassette transporter)A1/G1(ABCA1/ABCG1)的表达情况;用TLR4阻断剂TAK-242(5μmol/L)或c-Jun氨基末端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinases 1/2,JNK 1/2)阻断剂SP600125(90 nmol/L)预处理的方式,观察TLR4及下游信号分子在oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物诱导A7r5表型转化和脂质转运分子表达变化的作用。结果 oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物明显上调细胞CD68和LGALS3水平,降低α-SMA表达,而TAK-242能够反转该现象;oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物能够促进细胞表达CD36,同时抑制ABCA1/ABCG1表达,TAK-242和SP600125能够逆转该过程。结论 oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物促进A7r5细胞向"巨噬样"细胞发生表型转变,调节脂质转运相关分子的表达,增强脂质向细胞内转运的能力;TLR4和JNK1/2与该过程密切相关。

SMMC-7721肝癌细胞膜上β_2糖蛋白Ⅰ受体的表达

目的:研究β2糖蛋白I(β22GPI)与 SMMC-7721肝细胞膜的相互作用过程,探讨乙型肝炎病毒(HBV)嗜肝性的发生机制．方法:采用荧光显微镜及流式细胞仪分析的方法．检测SMMC-7721、HL-60及SGC-7901 三种细胞膜与FITC-β2GP I相结合的情况以及二者的结合特性．结果:仅SMMC-7721细胞膜表面附有大量荧光,其余2种细胞无此现象．加FITC-β2GP I 20 μL时,SMMC-772 1与FITC-β2GP I 的结合率为19％,明显高于FITC-β2GP I与 HL-60的结合率(1．7％)及与SGC-7901的结合率(1．9％)(P<0．01)．加FITC-β2GP I 50μL 时,SMMC-7721与FITC-β2GP I的结合率为 20．8％,与20 μL的结合率无差异(P>0．05),说明SMMC-7721与FITC-β2GP I的结合率不随 FITC-β2GP I量的增加而增高．结论:在SMMC-7721肝细胞膜表面存在能与人β2GP I特异结合的蛋白．

β2GPⅠ/抗β2GPⅠ抗体复合物抑制oxLDL介导的THP-1巨噬细胞脂质蓄积和FAK活化

目的探讨β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ抗体复合物(β2/aβ2)对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)介导的THP-1巨噬细胞脂质蓄积和黏着斑激酶(FAK)活化的影响,以及Toll样受体4(TLR4)在该过程中的作用。方法用PMA(100 ng/mL)将THP-1细胞诱导为THP-1巨噬细胞。用RPMI 1640培养液、oxLDL、oxLDL+β2/aβ2和oxLDL+脂多糖(LPS)处理THP-1巨噬细胞,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测脂质转运相关分子ACAT1、ABCA1和ABCG1的mRNA水平;利用Trinder法检测THP-1巨噬细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)含量,并计算胆固醇酯(CE)含量和其占TC的比例;利用免疫荧光和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测FAK的蛋白质和mRNA表达并采用western blot检测其磷酸化;最后,利用TLR4阻断剂TAK-242(1μg/mL)预处理的方式,观察TLR4对上述过程的影响。结果β2/aβ2复合物能够抑制oxLDL引起的THP-1巨噬细胞脂质蓄积和FAK表达与磷酸化,阻断TLR4可以部分逆转这一现象。结论β2/aβ2可以抑制oxLDL引起的巨噬细胞的脂质蓄积和FAK活化,该过程与TLR4有关。

β2 GPⅠ及其抗体与抗磷脂综合征的研究进展

抗磷脂综合征（APS）是一种以血栓形成和（或）习惯性流产为临床特征的自身免疫性疾病。β2糖蛋白Ⅰ（β2 GPⅠ）是该病的主要抗原，抗β2 GPⅠ抗体是以β2 GPⅠ为靶抗原的自身抗体。研究表明，β2 GPⅠ及其自身抗体在 APS血栓形成的致病过程中起到重要作用。目前 APS的诊断与治疗也越来越受到人们的重视，检测抗β2 GPⅠDⅠ抗体能特异性诊断APS，分子水平的研究也成为治疗 APS的新方向。该文就β2 GPⅠ、抗β2 GPⅠ抗体与 APS的相关性进展作以综述。

TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA及碱性磷酸酶的表达

目的 :对TGF β增强rhBMP 2诱导成骨中CollagenⅠ、ⅡmRNA及碱性磷酸酶 (ALP)的表达进行研究。方法 :BALB/c小鼠 110只随机分 2组 ,每组 5 5只。rhBMP 2 /TGF β为实验组 ,rhBMP 2为对照组 ,于术后 3～2 1d 8个时间点取材 ,用原位杂交方法对新生骨组织中的Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA进行检测 ;对ALP活性进行定量分析 ,观察 2组在诱导成骨中CollageⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达情况。结果 :(1)Ⅱ型胶原mRNA的出现是和成软骨、软骨细胞的出现相伴随的 ;(2 )做为成骨细胞成熟标志物的Ⅰ型胶原mRNA、ALP在软骨形成期即有表达 ,随着成骨细胞的出现 ,骨组织的形成Ⅰ型胶原mRNA仍表现为高表达 ,而ALP的表达则呈下降趋势 ;(3 )实验组CollagenⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达早于对照组。结论 :TGF β增强了rhBMP 2诱导成骨中CollagenⅠ、ⅡmRNA及ALP的表达。

糖尿病病程联合24 h-UPr和β-CTX对2型糖尿病视网膜病变的诊断价值

目的通过研究2型糖尿病(T2DM)患者合并糖尿病视网膜病变(DR)的相关因素,探寻可能有价值的预测指标。方法回顾性分析2020年1月至2021年12月温州医科大学附属第二医院内分泌科收治的356例T2DM患者临床资料,根据眼底彩照和(或)眼底造影结果,分为DR组和非DR组(NDR组),采用两独立样本t检验、Mann-Whitney U检验和χ^(2)检验分析两组患者基线资料、生化相关指标、骨转换标志物和细胞因子表达水平,多因素logistic回归分析T2DM合并DR的相关因素,ROC曲线评估糖尿病病程、24 h尿蛋白定量(24 h-UPr)和Ⅰ型胶原交联C-末端Beta特殊序列(β-CTX)对T2DM合并DR的诊断效能。结果DR组与NDR组糖尿病病程、收缩压、24 h-UPr、血肌酐、血尿素氮、内生肌酐清除率、胱抑素C、尿β2微球蛋白、β-CTX、骨钙素N端中分子片段和25-羟基维生素D比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。多因素logistic回归分析显示β-CTX(OR=0.997,P<0.01)是DR的保护因素,糖尿病病程(OR=1.118,P<0.01)、24 h-UPr(OR=3.431,P<0.05)是T2DM合并DR的危险因素。糖尿病病程、24 h-UPr和β-CTX联合检测预测DR的ROC AUC为0.769,灵敏度为0.701,特异度为0.696;ROC曲线最佳截断值分别是8.5年、0.135 g/24 h和500 pg/mL。结论较低的β-CTX水平,较长的糖尿病病程和较高的24 h-UPr水平是T2DM合并DR的独立危险因素,3项指标联合检测对T2DM合并DR具有较好的预测价值。

SMMC-7721肝癌细胞膜上β_2糖蛋白I可能的受体

研究β2糖蛋白I(β2GPI)与肝细胞相互作用的过程,以进一步探讨β2GPI在乙型肝炎病毒感染肝细胞过程中所发挥的作用。采用L igand b lot技术,从SMMC-7721、HL-60及SGC-7901三个细胞株中,筛选出具有与人β2GPI特异结合蛋白成分的细胞。SMMC-7721细胞在40kD处出现一特异染色带,而HL-60及SGC-7901二种细胞则无此反应。在SMMC-7721细胞中存在有与人β2GPI特异结合的蛋白,这种蛋白可能参与了HBV感染肝细胞的过程。

Toll样受体4增强β2糖蛋白1免疫小鼠B细胞的活化

目的探讨Toll样受体4(TLR4)在β2糖蛋白Ⅰ(β2GP1)免疫的小鼠中,对B细胞活化过程的影响。方法将C3H/HeN(TLR4正常型)和C3H/HeJ(TLR4缺陷型)2种小鼠随机分为β2GP1免疫组和生理盐水对照组,分别注射β2GP1或等量的生理盐水进行免疫。采用皮下多点注射进行初次免疫,2次腹腔注射加强免疫,最后冲击免疫的方法免疫小鼠。采用间接ELISA检测小鼠血清中抗β2GP1抗体的效价;HE染色观察小鼠脾脏生发中心数量及大小的变化;免疫组织化学法观察脾脏生发中心内的CD40配体(CD40L)表达;流式细胞术检测小鼠脾脏B淋巴细胞中共刺激分子CD80和CD86的水平变化。结果经β2GP1免疫后,2种小鼠血清中均出现高效价的抗β2GP1抗体,且C3H/HeN血清效价高于C3H/HeJ小鼠。与生理盐水对照组相比,2种小鼠经β2GP1刺激后,CD40L、CD19+CD80+细胞和CD19+CD86+细胞的数量均显著增加;但C3H/He J小鼠CD40L,CD19+CD80+细胞和CD19+CD86+细胞的数量低于C3H/He N小鼠。经β2GP1刺激的小鼠脾脏生发中心,比生理盐水组更大更多,C3H/HeN小鼠的生发中心的数量多于C3H/HeJ小鼠。结论 TLR4增强β2GP1免疫小鼠B细胞的活化。

β_2糖蛋白Ⅰ与乙型肝炎病毒嗜肝性的关系

目的研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)与β_2糖蛋白Ⅰ(β_2GPⅠ)的结合特性,探讨β_2GPⅠ在乙型肝炎病毒(HBV)嗜肝性中的作用。方法采用Western blot技术,研究还原型与非还原型β_2GPⅠ与HBsAg的结合特性。结果还原型与非还原型β_2GPⅠ与HBsAg有相同的亲和力,推测β_2GPⅠ与HBsAg的结合部位是在一级结构上相邻的氨基酸残基肽段,与空间构象关系不大。结论HBV与β_2GPⅠ有特异的亲和能力,这一亲和能力可能在HBV感染肝细胞过程中发挥了重要作用,是HBV嗜肝性的原因之一。

活性氧在Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导中性粒细胞外诱捕网产生中的作用机制研究

目的探讨活性氧(reactive oxygen species,ROS)在抗β2糖蛋白Ⅰ(β2 GlycoproteinⅠ,β2GPⅠ)抗体/β2GPⅠ通过相关信号转导通路诱导中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)形成中的重要作用.方法提取健康志愿者中性粒细胞,PBS刺激作为PBS组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ(10/100μg/mL)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶抑制剂(DPI 20μmol/L)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activatedprotein kinase,MAPK)抑制剂(SB20358010μmol/L)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)抑制剂(U012610μmol/L)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)(50 nmol/L)刺激作为PMA组.流式细胞仪检测中性粒细胞ROS的释放;Western blot检测中性粒细胞p38MAPK、ERK活化.结果与anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组相比,anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组、anti-β2 GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组活性氧释放百分率减少,且anti-β2 GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组抑制作用更明显[anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组:(35.21%±1.22%)比(1.62%±0.08%),P<0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组比Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组:(35.21%±1.22%)比(10.21%±0.98%),P<0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组:(35.21%±1.22%)比(8.36%±0.62%),P<0.05)].Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组分别使p38 MAPK、ERK磷酸化水平下降(anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:[(0.601±0.031)比(1.212±0.132),P<0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:(0.107±0.001)比(1.612±0.096),P<0.05)],而anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组p38 MAPK、ERK磷酸化水平均无明显下降[anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:(1.198±0.068)比(1.212±0.132),P>0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:(1.682±0.091)比(1.612±0.096),P>0.05].结论健康志愿者中性粒细胞受anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激形成NETs的过程依赖于相关通路(p38MAPK、ERK)的活化及ROS的释放.p38MAPK、ERK为激发ROS释放的上游信号通路.