C型产气荚膜梭菌β_1、β_2毒素基因的融合

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出 β1 和 β2 毒素基因 ,构建了含 β1 - β2 融合基因表达质粒的重组菌株BL2 1(DE3) (pETXB1_2 )。经酶切鉴定和序列测定证实 ,构建的重组质粒pETXB1_2含有 β1 - β2 融合基因 ,且基因序列和阅读框架正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的 β1 - β2 融合蛋白能够被 β1 、β2 毒素抗体识别。免疫实验结果表明 ,用β1 - β2 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9_4 4毒素攻击 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。

C型产气荚膜梭菌α、β_1、β_2毒素基因融合及免疫原性研究

为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXA1中扩增出0.95 kbα毒素基因,将其连接到经NcoⅠ单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kbβ1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kbα-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol?L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株.

产气荚膜梭菌的β_2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌中国标准株C5 9— 4 4基因组DNA中扩增出了约 0 .7kb的基因 ,并将其克隆到pGEM T载体上 ,经酶切鉴定及核苷酸序列分析表明 ,该基因片段的核苷酸序列与国外报道的 β2 毒素基因序列一致 .

C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了0.72kb的β2毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI/BamHI和BamHI/EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPB2中含有β2毒素基因。随后用NcoI/BamHI酶切质粒pXCPB2,回收β2毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXB2,经NcoI/BamHI和NcoI/HindⅢ/BamHI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有β2毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pETXB2)表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,重组菌株表达的β2毒素蛋白能够被β2毒素抗体识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的13.26%。

从A型产气荚膜梭菌C57-1中发现β2毒素基因

为了进一步研究A型产气荚膜梭菌C571株的遗传学背景,应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从该菌株中扩增出大小为726bp的β2毒素基因(cpb2基因)的部分序列,并将其克隆入pMD18-T载体中。转化至受体菌DH5α后,经Amp/IPTG/X-Gal选择培养,提取质粒,筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实,该基因片段与文献报道的β2毒素基因序列一致。

猪源A型产气荚膜梭菌β2毒素与宿主细胞互作蛋白的筛选鉴定

产气荚膜梭菌产生的β2毒素在仔猪肠炎中起着重要作用,为研究该毒素侵入宿主细胞的作用机制,本研究以β2为诱饵蛋白,将其与酿酒酵母转录因子GAL4的BD(DNA binding domain)融合表达,利用猪肠上皮细胞系IPEC-1的cDNA文库与GAL4的AD区(Activation domain)融合表达,通过酵母双杂交系统筛选鉴定与β2毒素相互作用的猪肠上皮细胞蛋白。筛选得到的阳性转化子经提取质粒和测序后,比对其所包含的编码蛋白序列,得到4个潜在的与β2毒素存在相互作用的细胞蛋白,分别为S20、LGALS1、L12和Atrophin-1。其中S20、L12和Atrophin-1是位于细胞内的核蛋白,而LGALS1是一种存在于细胞膜外侧的半乳糖凝集素,可能是毒素的作用位点。对LGALS1进行回交验证,结果显示其C端与β2毒素的相互作用强于其完整蛋白与β2毒素的相互作用。本研究结果对研究β2毒素的致病机制奠定了基础。

新疆部分地区羊源性产气荚膜梭菌的分离及其主要毒力基因的检测

为了解新疆部分地区羊源性产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的毒型分布,对疑似病例所采病料进行了菌株分离,用多重PCR方法对菌株进行了毒素分型,用PCR方法对β2毒素基因(cpb2)和肠毒素基因(cpe)进行了检测。结果,在分离的39株菌中,毒素A型占66.67%(26/39),毒素B型占2.56%(1/39),毒素D型占30.77%(12/39);66.67%(26/39)的菌cpb2基因阳性,A、D型菌cpb2基因阳性率分别为42.31%(11/26)和100%(12/12);cpe阳性率为51.28%(20/39),其中A型菌cpe阳性率为50.00%(13/26),D型菌cpe阳性率为58.33%(7/12);cpb2和cpe双阳性菌株占38.46%(15/39)。上述结果为防治新疆羊源性产气荚膜梭菌感染提供了基础资料。

乳糖诱导剂及培养条件对C型产气荚膜梭菌茁β_2毒素基因表达影响

本研究对已构建的含茁2毒素基因重组质粒pE TXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测在不同培养条件下茁2毒素基因的表达情况。经酶切鉴定证实pE TXB2重组质粒含有茁2毒素基因而且阅读框架和基因序列正确。同时,采用乳糖诱导剂通过改变培养基的pH值、培养温度、诱导剂的加入量及诱导时间四个方面对茁2毒素基因表达进行调控,从而为茁2毒素基因工程菌的工业化生产提供了可靠的试验数据。