牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20(exon)融合蛋白间接ELISA检测方法的建立

【目的与方法】以纯化的牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20(exons)融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立了检测牛双芽巴贝斯虫血清特异性抗体的新型间接ELISA方法。【结果】方阵试验确定的GST-HSP20抗原的最适包被浓度为5μg/mL,血清最佳稀释倍数为40倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.292,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。HSP20间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与巢式PCR检测方法的阳性符合率为96%。【结论】所建立的ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高。这是国内首次利用重组蛋白建立的牛双芽巴贝斯病血清学诊断方法,为大规模地进行牛巴贝斯虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段。

牛双芽巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立

【目的与方法】根据Genbank上登陆的双芽巴贝斯虫HSP20基因设计两对引物,SHSP-P1与SHSP-P2和SHSP-P3与SHSP-P4,以其建立牛双芽巴贝斯虫巢式PCR快速检测方法。【结果】第一次、第二次扩增的退火温度均为57℃,分别扩增出约631和409 bp的条带,与预期的大小相符,而作为对照样本的牛巴贝斯虫、牛环形泰勒虫基因组DNA均无此扩增目的条带出现。将感染双芽巴贝斯虫的全血基因组DNA做10倍递减稀释到106倍扩增时,巢式PCR还能见到目的条带,其灵敏度相当于4.6 pg/mL全血基因组DNA。在对50份疫区牛全血DNA样本检测中,阳性检出率分别为22%(11/50)。【结论】所建立的牛双芽巴贝斯虫巢式PCR方法准确、敏感、特异,可以用于牛双芽巴贝斯虫病的快速检测和小范围的流行病学调查,具有重要的临床意义。

甘肃省玛曲牦牛双芽巴贝斯虫血清学调查及风险因素分析

本研究旨在调查甘肃省玛曲地区牦牛双芽巴贝斯虫病的流行情况并对可能影响其感染的因素进行深入分析。本试验采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法对该地区的600份牦牛血清样品进行检测,随后运用流行病学、统计学方法对可能影响牦牛双芽巴贝斯虫感染的因素进行全面分析。调查结果表明,该地区牦牛双芽巴贝斯虫抗体阳性率为22.33%,其中性别和采样季节两个因素对牦牛双芽巴贝斯虫感染的影响均不具备显著统计学意义(P>0.05),而年龄因素对牦牛双芽巴贝斯虫感染的影响具有显著统计学意义(P<0.05)。综上所述,甘肃省玛曲地区牦牛双芽巴贝斯虫普遍流行并具有较高的感染率,存在向牧区其他放养牦牛及野生动物传播该病的风险隐患。因此相关部门应针对该地区牦牛双芽巴贝斯虫感染情况采取有效的预防、控制措施,严防该病扩散蔓延,保证当地及周边藏民牦牛养殖的经济效益。

牛双芽巴贝斯虫新疆株HSP20基因的克隆和真核表达质粒的构建

通过设计牛双芽巴贝斯虫热休克蛋白HSP20基因序列的特异性引物,采用PCR方法从疑似"牛焦虫病"的患牛全血基因组中扩增得到699 bp的HSP20基因,将其连入pMD18-T测序、鉴定,再将验证的699 bp的HSP20基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核载体PCDNA3.1-HSP20。经再次测序、鉴定后,尾静脉注射小白鼠进行HSP20基因的瞬时表达,取其肝脏提取总RNA,经RT-PCR方法扩增出一条534bp的目的条带,表明真核表达质粒构建成功。

牛双芽巴贝斯虫病的防制研究

在流行病学调查基础上，采取控制传播媒介和药物预防注射为中心的综合防制措施。在蜱活动的4～11月份，选用双甲脒和螨净，进行牛体表喷洒灭蜱，两种灭蜱药每半月交替使用一次。在牛双芽巴贝斯虫病发病季节5～9月份，选用贝尼尔、咪唑苯脲进行两次预防注射或缓释剂一次预防注射。经过二年防制工作，防制点没有发生牛双芽巴贝斯虫病。牛体蜱数从9～282只／头次下降到0～11．3只／头次。间接血凝试验结果显示，牛阳性率从10％下降到防制后第一年的3．22％和第二年的0；间接荧光抗体试验表明，牛阳性率从23．63％下降到防制后第一年的6．56％和第二年的0。在防制点二头哨牛，经一年的自然放牧，没有发生双芽巴贝斯虫病，血清抗体效价也没有上升，在推广点的应用，也取得良好效果。

南德文种牛发生巴贝斯虫病

本文报道南德文种牛发生双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫病的诊断和治疗。对病牛主要采用血虫净按４ｍｇ／ｋｇ体重剂量，用无菌蒸馏水配成５％溶液肌注，每天１次，连用３天，大部分病牛停止便血尿，开始采食。

牦牛及犏牛奶中乳糖含量分析

测得红原、阿坝两县牦牛及红原犏牛奶中乳糖含量分别为４．３５％、５．０７％、５．４１％，略低于其他牛奶．

双芽巴贝斯虫体外培养技术初探

应用双芽巴贝斯虫染虫血和液氮保藏株，进行体外培养技术初步研究，获得了生长、增殖和保种效果。双芽巴贝斯虫在牛红细胞内带虫率达５％，低染虫率的连续培养已超过２５ｄ。奠定了双芽巴贝斯虫培养技术应用基础。

我国西北地区奶牛双芽巴贝斯虫病血清流行病学调查及风险因素分析

本研究旨在调查我国西北部的甘肃省和宁夏回族自治区奶牛双芽巴贝斯虫的感染情况,分析影响其感染的风险因素。本次调查共采集奶牛血清1 657份,通过ELISA试剂盒检测抗体,结果显示总体感染率为8.09%。采用Logistic回归分析,评估奶牛双芽巴贝斯虫感染的风险因素,结果显示奶牛所在的地区是影响奶牛双芽巴贝斯虫感染的重要风险因素(P<0.05)。本研究弥补了我国西北地区奶牛双芽巴贝斯虫感染数据的空白,对预防和控制双芽巴贝斯虫感染提供了帮助。

快速检测双芽巴贝斯虫LAMP方法的建立

为提高双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)检出率,本研究采用环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种快速、灵敏、特异的B.bigemina检测方法。根据GenBank上公布的Babesia bigemina细胞色素b(Cytochrome b,cyt b)基因序列,设计4条特异地识别B.bigemina的cyt b基因6个特殊区域的LAMP引物,优化反应体系和条件,在Bst DNA聚合酶的作用下,65℃反应60min,加入SYBR GreenⅠ后观察。结果表明,该LAMP检测方法特异性强,与牛巴贝斯虫(Babesia bovis)等DNA不发生交叉反应;敏感性高,对B.bigemina的cyt b基因最小检测值为0.085fg/μL,是一般PCR方法的1000倍。该方法具有简单、快速、低成本的特点,可用于B.bigemina的基层现场快速检测。

牛双芽巴贝斯虫rap-1基因的克隆与序列分析

对牛双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)潜在药物靶标Rap-1的基因进行克隆与序列分析。以兰州株牛双芽巴贝斯虫基因组为模板,经PCR扩增获得了rap-1基因,将该基因克隆到pGEM-T Easy Vector上,对重组质粒进行PCR扩增,对目的基因进行酶切鉴定及序列测定分析。结果表明,rap-1基因长度为846 bp,同源性分析结果显示,克隆序列与GenBank收录的巴西株牛双芽巴贝斯虫的核苷酸序列同源性为99.74%,说明兰州株牛双芽巴贝斯虫的rap-1与GenBank公布的参考基因具有高度同源性,rap-1基因具有很高的保守性。

一例牛双芽巴贝斯虫、大肠杆菌混合感染的实验室诊断

为了查明义龙新区某养牛场牛发病死亡原因,试验采集病牛内脏组织器官及全血样本,通过细菌分离培养鉴定及PCR检测技术对病料进行检测,并对分离菌进行药敏试验。结果表明:从肺脏样品中分离出革兰氏阴性短杆菌,16S rDNA测序分析鉴定为大肠杆菌,药敏试验显示其对硫酸新霉素高敏。全血样本中牛双芽巴贝斯虫核酸检测结果为阳性,而牛支原体、牛巴贝斯虫、牛附红细胞体核酸检测结果均为阴性。说明发病牛感染了牛双芽巴贝斯虫与大肠杆菌。

新疆牛双芽巴贝斯虫病的流行病学调查

本研究使用牛双芽巴贝斯虫HSP20(exon)-iELISA检测方法,对2006-2008年新疆14个地州市的牛双芽巴贝斯虫病流行病学进行了调查。结果显示:(1)新疆存在着牛双芽巴贝斯虫病,且比牛巴贝斯虫病严重。在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清11份,感染率为5.40%。2007年的532份牛血清样品中检出阳性血清25份,感染率为4.70%。在2008年的530份牛血清中检出阳性血清53份,感染率为7.17%;(2)2008年,发病疫区内牛双芽巴贝斯虫感染率高达30%;(3)牛双芽巴贝斯虫感染的地州市由2006年的8个扩大到2008年的13个;(4)新疆牛双芽巴贝斯虫病的感染率逐年上升,疫区面积不断扩大,流行区内感染率激增。这是新疆首次利用血清学方法对全疆范围内牛双芽巴贝斯虫病进行大规模的流行病学调查。

双芽巴贝斯虫Hsp20一新基因型的发现及生物学特性分析

为了鉴定分离自甘肃永靖的1株双芽巴贝斯虫Hsp20基因型为一新基因型,参考双芽巴贝斯虫Hsp20核苷酸序列,设计特异性引物。对其进行扩增,利用生物信息学方法对其进行比对分析。结果显示,扩增获得了700 bp的核苷酸片段。与GenBank中公布的18种不同物种的氨基酸序列构建遗传发育树,结果表明本实验获得的双芽巴贝斯虫与美国株和中国新疆株的亲缘关系最近。对其氨基酸序列进行比对分析,发现在第31～85位点存在冗余,与公布的Hsp20氨基酸序列存在明显的差异。通过同源建模分析,发现该冗余致使Hsp20蛋白在第7号位形成1个环形结构,从而引起了第3号位的拉伸。通过生物信息学分析得出,获得的双芽巴贝斯虫甘肃株的Hsp20基因是一新基因型。该基因型的存在为更加准确诊断双芽巴贝斯虫病提供了依据。

贵州省施秉县媒介蜱携带双芽巴贝斯虫的调查研究

目的了解贵州省施秉县蜱的双芽巴贝斯虫感染情况。方法于2021-2022年在贵州省施秉县采集散养黄牛体表寄生蜱,经形态学分类后辅以16S rDNA及细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COX1)基因检测鉴定蜱种类;用梨形虫18S rDNA对样本进行初筛,后用双芽巴贝斯虫顶端膜抗原1(AMA-1)基因进行PCR验证及序列测定,所测序列通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)的BLAST进行比对,采用邻接法构建进化树,掌握施秉县蜱携带双芽巴贝斯虫的遗传进化特征。结果共采集蜱样本615只,分子生物学鉴定有2属4种,分别为微小扇头蜱、镰形扇头蜱、长角血蜱和北岗血蜱;从微小扇头蜱体内检测到双芽巴贝斯虫核酸片段,结果表明,AMA-1基因序列与从菲律宾的牛血及苏丹的小亚璃眼蜱中检出的双芽巴贝斯虫有较近的亲缘关系,18S rDNA基因序列与印度的双芽巴贝斯虫亲缘关系最近。结论施秉县散养家畜体表寄生蜱体内携带双芽巴贝斯虫的核酸片段,提示施秉县媒介蜱可能存在巴贝斯虫感染。研究结果可为该地区开展蜱传原虫病防治工作提供参考数据。

双芽巴贝斯虫RAP-1C基因的克隆表达及重组蛋白反应原性的研究

拟通过对双芽巴贝斯虫棒状体相关蛋白1(rhoptry-associated protein-1,RAP-1)羧基端进行研究,以期了解该蛋白的一些免疫学特性。利用生物信息学软件,对RAP-1进行抗原表位预测,并与其他重要的巴贝斯虫和泰勒虫相应基因序列进行比对,以筛选出抗原性和特异性均良好的基因片段;针对筛选出的基因片段设计引物,对该基因进行克隆和原核表达,最后利用Western-blot对重组蛋白的反应原性和特异性进行分析。结果显示,融合目的蛋白含His标签,分子质量为26ku左右,该蛋白只与双芽巴贝斯虫阳性血清发生特异性反应,与其他主要巴贝斯虫、泰勒虫的阳性血清无交叉反应。结果表明,表达的PAP-1蛋白可作为ELISA诊断方法的候选抗原,为建立一种双芽巴贝斯虫病特异性的免疫学诊断方法奠定了基础。

双芽巴贝斯虫在长角血蜱肠内发育的形态学研究

以耳袋法将长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)幼虫饲于实验感染双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)牛,幼虫饱血后24h内,其肠管内容物中红细胞内、外见有单梨子型(3.5～4.5μm×1.2～2.6μm)和双梨子型(4.1～4.8μm×1.8～3.0μm)两种裂殖体.饱血后24～48h,随着裂殖体细胞膜及核变性而发生形态变化.48～72h,绝大多数裂殖体出现溶解.72h后,这些裂殖体从肠道消失.其后,在蜱肠上皮及血淋巴中也未能找到双芽巴贝斯虫体.本实验从形态学上证明双芽巴贝斯虫在长角血蜱若虫肠道内不能发育.