β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg^(2+)、Mn^(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。