酸性微环境对巨噬细胞中周期生物钟1的表达及M2型极化的影响

目的探讨酸性微环境对巨噬细胞中周期生物钟1(PER1)的表达及替代途径激活的巨噬细胞(M2型)极化的影响。方法20只6~8周龄C57/6J雌性小鼠,腹腔注射含5%淀粉的生理盐水,连续3 d,麻醉处死,对小鼠腹腔灌流并回收灌流液,接种至6孔板培养2 h,贴壁细胞即为小鼠腹腔巨噬细胞,分别加pH7.3培养基(pH7.3组)、pH6.5培养基(pH6.5组)及0.02 mol/L乳酸培养基(0.02 mol/L乳酸组),培养24 h;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测3组小鼠腹腔巨噬细胞中白细胞介素1β(IL-1β)、血管内皮因子(VEGF)、精氨酸酶-1(ARG-1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及PER1信使RNA(mRNA)的表达,采用酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)检测3组小鼠腹腔巨噬细胞中IL-10、IL-12、VEGF、肿瘤坏死因子α(TNF-α)蛋白的水平;溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、二油酰基磷酰基乙醇胺(DOPE)、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)-琥珀酰胺(DSPE-PEG2000-NHS)按摩尔比为7∶7∶5∶1溶解于氯仿溶液,使用旋转蒸发仪旋蒸形成脂质体薄膜,加无核酸酶双蒸水采用超声水浴仪和小型挤压器制备单层脂质体,使用无酶水溶解PER1小干扰RNA(siRNA)并与脂质体溶液按照1∶10的质量比于室温下震荡混匀,按照1∶1000体积比加别藻蓝蛋白-甘露糖受体(APC-CD206)抗体得脂质体-PER1复合体(Lipo-PER1)阳离子脂质体,采用透射电子显微镜电镜观察Lipo-PER1复合体形态与结构;B16-F10黑色素瘤细胞和RAW264.7巨噬细胞按1∶1比例共培养,共聚焦显微镜观察B16-F10黑色素瘤细胞和RAW264.7巨噬细胞对Lipo-PER1的摄取;对数期生长的RAW264.7巨噬细胞分别加Lipo-PER1、脂质体-阴性对照(Lipo-NC)复合体,培养6 h,采用RT-PCR和ELISA法检测2组RAW264.7巨噬细胞中IL-1β、抗原分化簇86(CD86)、ARG-1、L-10 mRNA及TNF-α、转化生长因子-β(TGF-β)蛋白的表达。结果与pH7.3组对比,pH6.5组和0.02 mol/L乳酸组小鼠腹腔巨噬细胞IL-1βmRNA表达下调(P<0.05),ARG-1、VEGF、HIF-1α及PER1mRNA表达上调(P<0.05),IL-12、TNF-α蛋白水平减少(P<0.0001),IL-10、VEGF蛋白水平增加(P<0.01);透射电镜与共聚焦显微镜观测结果表明,Lipo-PER1构建成功并能成功被巨噬细胞摄取;与Lipo-NC组比较,Lipo-PER1组RAW264.7巨噬细胞中I L-1β、CD86 mRNA表达上调(P<0.05或P<0.001),ARG-1、IL-10 mRNA表达下调(P<0.01或P<0.05),TGF-β蛋白表达增加(P<0.0001),TNF-α蛋白表达减少(P<0.05)。结论酸性微环境能上调巨噬细胞中PER1的表达,进而促进巨噬细胞M2型极化。