以EV71抗原检测方法验证浅析生物制品生物效价检测方法学验证

目的:本文以对生物制品生物效价检测进行规范的《中国药典》2020年版新增9401指导原则为标准进行EV71抗原检测方法的验证,进一步浅析生物制品生物活性/效价检测的方法学验证。方法:依据《中国药典》2020年版9401指导原则,结合EV71抗原检测方法特点及验证目的对其进行专属性、相对准确度、精密度、线性和范围5个方面进行方法学验证。结果:EV71抗原检测方法专属性强,6个效价水平几何变异系数为4.7%~13.0%,均小于15%,相对偏倚为-6.05%~9.03%,均在±15%范围内,定量范围为225%~31%,线性回归相关系数为0.999 5,5方面验证均符合要求,且适用于该检测方法的使用。结论:本原则可具体指导生物学检测方法验证,在对不同检测方法进行验证时,根据检测目的、方法的原理、方法的技术特点、被检物的成分等设计具体方案。

基于超声透射法的组织特性谱分析

针对生物组织的超声诊断问题,基于超声透射法在生物组织中的传播机理,分析了超声在生物组织中的传输衰减特征与生物组织特性及超声频率参数间的关系,提出了超声波在生物组织中传输衰减的理论计算公式。经过计算比较,实验值与理论计算接近,该理论公式可以应用于对生物组织状况的分析。通过超声透射法对生物组织进行实验检测,证实了理论公式定量评估组织状态的有效性,同时表明基于超声透射法的谱分析对组织的可辨识度高,提高了超声对生物组织结构状态诊断的有效性。

生物学验证法与汉语植物命名探求

名物考证,尤其是汉语植物命名探求在语言学界是公认的难题,探讨科学的名物探源方法尤为重要。本文认为,科学的名物训诂方法应是语源学与现代植物科学相结合,其中生物学验证法不仅为"因声求义"法提供旁证,还可辨析歧训异说,匡正旧说谬论,在汉语植物命名探求中有着十分重要的价值。

毛细管电泳用于药物分析的研究进展

药物分析是毛细管电泳(CE)的重要应用领域,所有CE分离模式与检测方法都在各种药物及其不同形式样品的分离分析中显示出特色和应用能力。该文从药品分析领域中的小分子药物(包括手性药物)及其有关物质、中药与天然产物、体内药物分析、生物制品药物分析等几个方面,综述了近几年CE在这些传统药物分析领域应用的研究进展。限于篇幅,未包括现代药物分析研究比较活跃的理化常数测定、亲和毛细管电泳与结合常数研究(药物与受体间的相互作用等)、临床生物标志物分析、代谢组学和微流控芯片CE分析等方面的内容。根据目前传统药物分析领域的发展,该文关注到近期CE在顺应药物分析的法规需求、电容耦合非接触电导检测(CE-C4D)、改进检测灵敏度与精密度、CE-十二烷基硫酸钠(SDS)毛细管电泳、全柱成像毛细管等电聚焦(icIEF)、抗体分析等方面的新进展。该文结合文献,讨论了目前传统药物分析领域的需求,以及CE在其中的地位、挑战和机遇。对目前CE主要作为互补分析方法在化学药和中药分析中的应用研究提出了一些针对性的建议,期待CE在生物制品分析中的特色和能力得到进一步的发挥,同时提出CE-MS和对CE分析重复性改进等新进展可能对未来CE应用领域的大幅度扩展。该综述主要涉及近3年(2017年1月到2020年2月)及部分2016年的相关文献。

基于栅藻延迟发光表征中药药性的方法学验证

对栅藻延迟发光定量化表征中药寒热药性的方法进行优化,并进行方法学验证。用YPMS-2生物光子测量仪检测栅藻激发延迟发光强度,对测得的激发延迟发光强度用Statistica 10.0软件进行线性拟合,得到表征栅藻性质的可靠参数K,用产自于道地产地的经典寒性中药黄芩作为样本,验证本研究方法的精密度、稳定性、重复性,并进行空白实验。栅藻最佳使用K值波动范围是2.81~3.89,本研究方法精密度高,重复性、稳定性良好,空白溶剂无干扰。

湿热灭菌课题的相关研究与思考

2017年上海市食品药品包装材料测试所作为协作单位受国家药典委员会的委托承担了药品医疗器械审批制度改革有关药品标准研究子课题——灭菌法(课题编号:ZG2017-4-03)中湿热灭菌部分的研究任务。通过借鉴国内外法规文献的经验,结合我国无菌药品生产实际情况,利用决策树和FMEA风险评估工具进行研究,并在厂家范围进行问卷调查,最后形成灭菌法湿热灭菌部分的修订稿。修订稿通过增加非无菌产品单元的概率、灭菌杀灭力值的控制意义,产品灭菌前微生物负载的控制等过程控制技术、生物负载/生物指示剂法等内容,对现行版的《中国药典》灭菌法部分进行修订完善(诸如删除流通蒸汽的内容),已使未来的《中国药典》2020年版中湿热灭菌法的内容能够与国际上其他通用标准初步接轨,并为国内无菌药品和医疗器械等生产企业的无菌保障工作起到切实可行的指导作用。

Quality-control method for the determination of biological activity of engineered calcineurin subunit B

The aim of this study was to establish a quality-control method for calcineurin subunit B(CNB) biological activity determinations. CNB enhances the p-nitrophenylphosphate(p NPP) dephosphorylating activity of calcineurin subunit A Δ316 mutant(CNAΔ316). A series of CNB concentrations were fitted to a four-parameter equation to calculate the corresponding p NPP maximum dephosphorylation rates. Values were calculated based on biological activity references using a parallel line method. The method was then validated for accuracy, precision, linearity, linear range, sensitivity, specificity, and robustness. The recovery results were greater than 98%. Intra-plate precision was 6.7%, with inter-plate precision of 10.8%. The coefficient of determination was greater than 0.98. The linear range was 0.05–50 μg m L?1, with sensitivity of 50 μg m L?1. Tested cytokines did not induce CNAΔ316 dephosphorylation of p NPP. The chosen CNAΔ316 concentration range did not affect activity determinations.

报告基因法测定人绒毛膜促性腺激素生物活性

本研究根据人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)与受体结合后激活cAMP信号通路,构建一种LHCGR-CRE-luc-HEK293转基因细胞系,采用荧光素酶检测系统对hCG进行生物活性检测,利用四参数拟合分析计算样品相对效价。并且对该方法条件进行优化,对方法的专属性、相对准确度、精密度和线性进行验证。结果显示,hCG浓度与报告基因表达量存在量效关系,且符合四参数曲线。经优化后,条件确定为hCG初始浓度为2.5μg·mL-1,稀释倍数为1∶4,细胞数为每孔10000~15000个,诱导时间为6 h。该方法具有良好的专属性,相对准确度的相对偏倚范围在-8.9%~3.4%,线性回归方程相关系数为0.996,中间精密度几何变异系数范围为3.3%~15.0%,线性范围为50%~200%。本研究成功建立并验证了一种报告基因法检测hCG生物学活性,可以用于hCG生物活性检测和质量控制。

重组人促卵泡激素体外生物学活性测定方法的联合验证

为探索基于报告基因的重组人促卵泡激素体外生物学活性测定方法的标准化应用前景,进行实验室间的联合验证。按照《中华人民共和国药典》2020年版通则9401对该方法进行相对准确度、中间精密度、线性与范围等方法学验证;联合3个实验室采用本方法测定来自不同生产企业的6批制剂及3批原液的体外生物学活性,对测定结果进行实验室间一致性分析以及实验室内、实验室间精密度分析;据联合验证中发现的问题对方法进行调整优化。实验室内方法学验证的结果符合《中华人民共和国药典》2020版四部通则9401的要求;针对联合验证中发现的问题,对细胞铺板培养基、标准品及供试品的预稀释缓冲液、加药后吸弃上清方式进行了优化,优化后各实验室之间的测定结果无显著差别(P>0.05),具有统计学等效性;实验室内及实验室间精密度良好,几何变异系数(GCV%)均小于15%。综上,本方法具有良好的实验室内重复性及实验室间重现性,且适用于不同生产厂家的重组人促卵泡激素制剂与原液产品,有望作为测定此类产品体外生物学活性的标准化方法进行推广。

In-cell Western法测定人胰岛素生物学活性

目的:利用in-cell Western(ICW)技术研究基于转基因细胞的人胰岛素生物学活性测定方法。方法:以CHO-INSR B1284为靶细胞,用不同浓度的人胰岛素刺激靶细胞,采用ICW技术检测人胰岛素受体酪氨酸磷酸化水平,进行人胰岛素的体外生物学活性测定;根据《中华人民共和国药典》2020年版通则9401“生物制品生物活性/效价测定方法”对该方法进行专属性、相对准确度、中间精密度、线性与范围等方法学验证;以重组人胰岛素国家标准品为参比品,采用本方法测定人胰岛素原料药及其他人胰岛素类似物的生物学活性相对效价。结果:不同浓度的人胰岛素作用于CHO-INSR B1284细胞后具有较好的剂量依赖性;5个效价浓度的待测品经8次测定,相对效价的几何均值分别为:(63.76±4.38)%,(78.01±5.97)%,(99.52±4.62)%,(122.84±7.4)%,(151.71±8.81)%,相对偏倚均在±5%范围内,对应的几何变异系数(GCV,%)均<11%,GCV的置信上限均<20%;采用该方法能有效检测人胰岛素及其胰岛素类似物的效价。结论:利用ICW技术的人胰岛素体外生物学活性测定法专属性强、准确度高、精密度好,可作为人胰岛素生物学活性的常规检测方法。

人促红素注射液生物学活性体外法的ELISA验证

本研究用双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附试验)检测人促红素注射液(Human erythropoietin injection,EPO)中EPO效价,并对其进行方法学验证。研究从准确度、重复性、中间精密度、线性、耐用性等各方面,对ELISA检测EPO建立的体外生物活性测试方法进行方法学验证。在准确度验证中,不同浓度供试品测定的回收率在87.20%~118.40%之间,同一浓度的6份样品的加标回收率为93.5%~107.2%之间;将5个不同浓度的供试品分别为2.5,5,20,50,100 mIU/mL进行3次重复性试验,结果RSD均<20%;在中间精密度验证过程中,在不同时间由不同人员各操作测定,检测结果的RSD=0.019%,<20%,人员和时间对结果均无统计学意义影响(P>0.05,F=0.043);线性验证实验结果表明,人促红素国家标准品和EPO成品重复3次的R2分别为0.9872,0.9968,0.9893,0.9978,0.9988,0.9856,均>0.98;在试验加入终止液后,不同长度时间间隔内的生物学活性测定结果均无统计学差异(One-way ANOVA检验,α=0.05,P>0.05,P((3))=0.354,P((6))=0.559,P((9))=0.679,P((12))=0.854)。本研究对EPO的双抗体夹心ELISA检测体系进行方法学验证,表明该ELISA方法专属性强、灵敏度高,结果稳定,可满足2020版版药典对人促红素注射液生物学活性体外效价质控的检测,可用于EPO效价的测定。

生物样品分析方法验证中的交叉验证

目的:明确交叉验证在生物样品分析方法中的作用、地位和必要性。方法:参阅国际上有关方法学验证的指导原则及文献,总结分析方法交叉验证在生物样品分析中的重要性和必要性,并通过实例建立不同实验室生物样品分析中的交叉验证流程,探讨现有操作流程的局限性。结果与结论:交叉验证结果表明,不同实验室的分析结果存在一定差异,但是符合可接受标准。交叉验证在生物样品分析中具有重要意义,需要得到重视并建立完善的操作流程及考核标准。

时间分辨荧光免疫分析法测定人胰岛素生物学活性

目的:利用时间分辨荧光免疫分析系统建立人胰岛素基于转基因细胞的生物学活性检测方法。方法:以CHO-INSRB1284转基因细胞2.5×10^(5)个·mL^(-1)作为靶细胞,以400 pmol·mL^(-1)作为初始浓度对人胰岛素进行3倍系列稀释,随后药物与靶细胞作用20 min,通过时间分辨荧光免疫分析系统,进行生物学活性检测,对该方法进行关键参数的优化,并依据2020年版《中华人民共和国药典》四部通则9401和ICH指导原则Q2(R1)、Q6B进行验证。结果:人胰岛素在本方法中存在良好的量效关系,符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D。本方法专属性强,5个效价水平(64%、80%、100%、125%及156%)的相对生物学活性(n=8)的几何平均值分别为(55.8±2.06)%、(82.1±5.52)%、(94.4±5.46)%、(121.4±5.94)%、(154.4±8.37)%,相对偏倚及其90%置信区间分别为-12.8%(-16.3%,-9.9%)、2.6%(-4.4%,9.5%)、-5.6%(-11.2%,-0.3%)、-2.9%(-7.7%,-1.8%)、-1.0%(-7.1%,3.9%),相对偏倚及置信区间的绝对值均不超过20%,表明该方法相对准确度良好。5个效价水平的几何变异系数(GCV)及其置信区间的上限均小于20%,结果证明此方法精密性较好。线性范围为64%~156%,斜率为1.031,R;大于0.98。结论:本研究利用时间分辨荧光免疫分析系统成功建立了人胰岛素基于转基因细胞的生物学活性检测方法,该方法可用于人胰岛素体外药效评价和质量控制。

生物活性检测方法验证统计分析软件的设计和功能

生物活性检测方法验证(biological method validation, BMV)统计分析软件是一款具有全部自主产权的专用统计分析软件。其优势在于:(1)提供常见的方法验证性能参数,如精密度及其置信上限、准确度及其相应的置信区间、范围等;(2)提供满足方法需求的判定标准,如分析总误差、报告值的预测区间、容忍区间、方法能力指数(MCI)等;(3)新增方法应用指标,包括操作模式变异度、报告值的区分阈值、能力验证标准差、方法关键影响因素分析等;(4)为使用者提供自主选择生物实验系统适用性模型,并可计算验证实验所需样本量。此软件不仅操作简便,而且输出结果科学可靠,可满足各国药典或指南对方法验证的要求。该软件的开发,将方便于药品行业研发人员建立科学可靠的生物活性检测方法,以确保药品的质量安全。

基于Nb2-11细胞增殖的重组人生长激素生物学活性测定方法考察

该研究建立了基于细胞的重组人生长激素(rhGH)生物学活性检测方法,以替代动物体内试验法。首先,用不同浓度的rhGH刺激大鼠淋巴瘤细胞株(Nb2-11细胞)增殖,采用发光活细胞检测系统测定细胞增殖情况,并利用四参数拟合分析计算样品相对效价。随后,对试验条件进行了优化,并对方法的专属性、相对准确度、精密度和线性进行验证,结果显示方法专属性较好,相对准确度的相对偏倚范围为–6.2%~0.9%,线性回归方程相关系数为0.9850,中间精密度几何变异系数范围为5.2%~7.7%,线性范围为50%~200%。最后用该方法和动物体内试验法分别检测15批rhGH原液的生物学活性,结果显示该方法检测结果与动物体内试验法检测结果的一致性良好。该研究建立并验证了测定rhGH生物学活性的Nb2-11细胞增殖法,可作为rhGH生物学活性的常规检测方法用于rhGH的生物学活性评价和质量控制。

均相时间分辨荧光法测定人胰岛素生物学活性

建立基于均相时间分辨荧光免疫分析技术的人胰岛素体外生物学活性测定方法。利用CHO-INSR B1284转基因细胞,通过均相时间分辨荧光免疫分析系统检测人胰岛素的体外生物学活性;对靶细胞铺板密度、药物的量效范围、刺激时间等关键参数进行优化;验证方法的专属性、相对准确度、中间精密度、线性与范围,以及细胞的传代稳定性;以重组人胰岛素国家标准品为参比品,将本研究建立的方法应用于其他人胰岛素类似物原料药、制剂的生物学活性测定。结果表明人胰岛素及其类似物存在剂量效应曲线,R^(2)>0.995,符合四参数方程y=(A-D)/[1+(x/C)^(B)]+D。本方法专属性良好,64%、80%、100%、125%、156%共5个效价浓度的待测品相对效价(n=8)的几何均值、相对偏倚、几何变异系数(GCV,%)均符合《中华人民共和国药典》2020版四部通则9401的要求;且方法可适用于其他胰岛素类似物的生物学活性测定。该方法操作简便、耗时短、准确度高、精密度好,可用于胰岛素类产品的生物学活性评价和质量控制。

二氧化碳信号检测的快速微生物方法应用于细胞制品无菌检查的评估

目的:评价基于二氧化碳检测原理的BacT/ALERT 3D Dual-T?快速微生物检测系统作为药典无菌检查法的替代用于创新生物制品的可行性。方法:以细胞制品作为应用对象,参考各国药典及国外指导原则,研究快速方法在专属性、检测限、非劣效性方面是否可替代药典方法。结果:评价结果表明快速方法在专属性和检测限参数上达到了药典方法性能相当,大部分情况下可比药典方法更快地报告阳性结果,快速方法对产品质量的决策不劣于药典方法,且在数据完整性方面具备优势。结论:在风险管理的前提下,经验证的快速方法可作为药典无菌检查的替代方法用于创新生物制品的快速放行。

总有机碳(TOC)测定方法在疫苗生产企业清洁验证中的初步应用研究

目的:对疫苗生产企业的目标清洁产物的检测方法进行验证,以找到适合于疫苗生产企业制药设备清洁样品的检测方法。方法:规定残留限度10-5作为清洁验证的标准,对目标清洁产物稀释至10-5进行鉴别试验、总蛋白检测和总有机碳(total organic carbon,TOC)检测,对比分析选择适宜的清洁验证分析方法。结果:TOC分析方法精密度可达到要求。建立的清洁验证规程可行,对实际的清洁淋洗水样品进行检测,TOC数据重现性良好,RSD小于10%,低于设立的允许残留限值。结论:TOC分析方法适用于含有混合有机物清洁样品的检测,该方法非常适用于疫苗生产企业制药设备的清洁验证。

重组链激酶活性测定中图片上溶酶圈直径测量方法

目的:研究建立在图片上测量重组链激酶溶解圈直径的方法。方法:在图片上溶解圈边缘人工取点(大于3个),利用最小二乘法,回归计算圆方程,并编写了相应的计算软件(circular_regression),并对所建方法的各项指标进行验证。通过在不同人员,在不同时间里的重复测量来评价软件所得数据的准确性、线性、重复性和精密度。通过在不同电脑上安装该软件来评估同图备份中同一溶解圈直径,进行软件粗犷度分析。用所建方法与直接测量方法进行比较。结果:在对参考圆的测定中,实测值与理论值之间差小于理论值的1%,并且所得数值的线性好,实测值与理论值之间的相关系数>0.9999。从重复性和精密度上看,试验结果测量的RSD<1%。从软件的粗犷度上看,2台电脑的分析结果无差别。所建方法测量结果与直接测量方法测量结果之间无显著性差异。结论:该自制软件具有准确性高,精密度高,重复性好,线性好等特点,可以用于替代直接测量方法,用于重组链激酶活性检测分析。