基于pegB基因的鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别方法的建立

为建立一种能快速、准确、简便区分鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的方法,研究通过对鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌pegB序列进行分析,发现存在3个单核苷酸多态性位点,基于此建立了一种特异性PCR方法用于鉴别鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌。结果显示,该方法特异性强、耗时短,检测限为10.14 pg/反应。临床样品检测表明,该方法不仅具有良好的特异性,且操作比传统方法更为简便。该方法的建立为准确区分鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌提供了实用技术,将在分子检测中发挥重要作用。

陕西省猕猴桃溃疡病病原菌分离鉴定及分型研究

明确陕西省猕猴桃主产区丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)的变型,从而有针对性地制定猕猴桃溃疡病的综合防治策略,采集陕西省猕猴桃主产区周至、眉县、灞桥、渭南、长安和鄠邑不同年份发病样本进行病原菌的分离,对病原菌进行初步鉴定后再应用特异性PCR进行分子鉴定,并进行回接实验。从鉴定出的Psa菌株中选出16株不同年份不同地区的代表性菌株应用7个管家基因进行MLSA分型分析。共分离鉴定出86株不同地区不同年份的Psa菌株,并通过回接实验验证了其致病性。MLSA分型结果表明16株代表性Psa菌株均属于Psa3,且Psa3与Psa6的遗传距离最近。陕西省猕猴主产区的Psa变型为Psa3,近十年未发生变异。研究结果为今后Psa的检测鉴定及防治研究提供参考。

方斑东风螺肿吻症病原菌的分离鉴定及药敏分析

从海南省文昌县某养殖场患病方斑东风螺（Babylonia areolata）的吻、肌肉和肝脏中分离到2株优势菌。人工感染证实其中1株为致病菌，经形态学检测和生化鉴定，该病原菌为鳗弧菌生物变种Ⅰ（Vibrio anguillarum Biovar Ⅰ）。该病原菌对方斑东风螺的LD50值为1．7×10^6cfu／g。药敏试验表明派拉西林、罗红霉素、红霉素、洁霉素、氟哌酸、先锋必、妥布霉素、菌必治、复方新诺明、利福平、复达欣、呋喃妥因等12种抗生素类药物对该病原菌敏感。

华鲮烂尾病病原的分离鉴定及药敏分析

从患有烂尾病的华鲮(Sinilabeo rendahli)体内分离到两个优势菌株(编号:BB090516C-1和BB090516C-2),对分离菌株形态特征、主要理化特性等生物学性状鉴定后测定其16S rRNA序列并构建系统发育树,同时采用K-B琼脂扩散法进行药敏实验。结果显示:经人工感染试验,证实分离菌对华鲮有较强的致病性,该菌为革兰氏阴性、兼性厌氧发酵型短杆菌。经形态特征、培养特性和生理生化反应等指标分析鉴定结果显示该菌为维隆气单胞菌温和生物型(Aerom onas veronii biovar sobria)。用16S rRNA基因序列比对结果显示分离菌株与维隆气单胞菌的同源性高达99%,系统进化树中与维隆气单胞菌自然聚为一支,表明该菌为维隆气单胞菌温和生物型。用22种抗菌类药物进行药敏实验发现,该菌对头孢曲松、硫酸庆大霉素等9种抗菌类药物高度敏感,对新霉素等6种药物中敏,对氨苄青霉素等7种药物耐药。

鼠疫耶尔森菌生物型变异遗传基础的研究和新生物型——田鼠型的提出

目的 探究鼠疫耶尔森菌生物型变异的遗传基础。方法 通过全基因组序列的比较分析 ,鉴定可能与生物型变异相关的基因突变 ,采用DNA测序和位点特异性PCR的方法 ,分析基因突变在鼠疫耶尔森菌自然分离株中的分布。结果 田鼠鼠疫自然疫源地菌株在毒力、生化表型和分子特征上与其他型别鼠疫耶尔森菌相差很大。所有脱氮阴性菌株的napA基因发生了突变 ,所有甘油利用阴性菌株的 glpD基因发生了突变 ,所有阿拉伯糖利用阴性菌株的araC基因发生了突变。结论 提出了一个新的生物型———田鼠型 ;相应糖醇代谢相关基因发生突变是 4个生物型变异的遗传基础。

健康妇女下生殖道解脲脲原体及其分群分型研究

目的了解健康妇女下生殖道Uu携带情况和定量值,揭示正常携带状态下Uu的分群分型情况。方法对2005年4月至8月在中山大学附属第二医院体检中心进行体检的健康妇女1018例,取宫颈分泌物进行Uu FQ-PCR检测,Uu阳性标本再用RDB法进行Uu分群分型。结果1018例中Uu阳性371例(阳性率36.4%),其中Uu FQ-PCR<1×106copy/ml且Uu呈单独阳性289例(77.9%)。371例Uu阳性标本,可以检测出血清型的共337例,未检出34例,总检出率为90.8%。parvum群278例(82.5%),urealyticum群30例(8.9%),两群混合阳性29例(8.6%);parvum群中,血清1型单型别阳性50例(18.0%),血清3型单型别阳性81例(29.1%),血清6型单型别阳性111例(39.9%),血清14型单型别阳性4例(1.4%),多型别阳性32例(11.5%)。结论Uu在健康妇女下生殖道中存在无症状的携带状态。在健康妇女中,Uu主要表现为Uu定量<1×106copy/ml而且Uu呈单独阳性。健康妇女中Uu以parvum群占优势,并且以parvum群中的1、3、6型的单型别为主,提示parvum群,尤其是其中的1、3、6单型别是正常人群携带的可能性较大。

福建烟草青枯菌演化型及生化变种鉴定研究

本研究尝试采用国际上新兴的青枯菌演化型分类框架并结合传统的生化变种鉴定方法,旨在探究福建省烟草青枯病菌系的构成,从而揭示青枯病的流行规律,为指导烟草青枯病的抗病育种提供理论依据。2008~2009年,分别于福建省南平、三明以及龙岩地区田间烟草病株上分离获得了45个烟草青枯病菌株。经青枯菌演化型复合PCR检测,45个菌株均能够扩增得到片段大小分别为144 bp和280 bp的两条特异性扩增条带,从而表明全部分离菌株均系青枯菌演化型I型即亚洲分支菌株。继而基于45个分离菌株对3种双糖和3种己醇氧化利用能力的检测结果,鉴定出其中43个菌株属于青枯菌生化变种III,1个菌株属于生化变种IV,1个菌株属于非标准型生化变种（能利用山梨醇和甜醇,不能利用3种双糖和甘露醇）。该研究结果部分揭示了造成国外引进的烟草品种青枯病抗性水平下降或丧失的可能原因。

丁溃疡病的病原菌分离、鉴定与人工感染试验

采用细菌常规分离方法分离丁溃疡病病原,并对所获得的纯培养物进行VITEK-32鉴定和人工感染试验,结果显示:维罗纳气单胞菌温和其变种是丁溃疡病的主要病原菌。

不同生物群解脲脲原体对红霉素耐药基因的分布差异

目的探讨不同生物群解脲脲原体对红霉素耐药基因分布差异。方法对73株从泌尿生殖道分离的解脲脲原体进行体外药物敏感试验,筛选耐药菌株并进行分群,设立临床敏感菌株组以及标准菌株组为对照,用PCR测序法检测23SrRNA的V区热点突变,用特异性引物PCR检测甲基化酶(ermA,ermB,ermC)、主动外排泵(mefA/E,msrA/B,mreA)等可转移耐药基因。结果 73株临床菌株中,耐药菌株35株,其中Parvo生物群17株,T960生物群18株;在耐药菌株组发现ermB耐药基因19株(其中Parvo生物群9株,T960生物群10株)和msrA/B耐药基因(其中Parvo生物群9株,T960生物群0株)的阳性扩增,同时含有ermB和msrA/B耐药基因2株,均在Parvo生物群耐药菌株中,未发现23SrRNA的V区点突变及ermA,ermC,mefA/E,mreA等其他可转移耐药基因;而临床敏感菌株组及标准菌株组均未发现所研究的耐药基因的阳性扩增。结论 Parvo生物群含有ermB和msrA/B两种机制,而T960生物群只发现ermB机制;msrA/B可能倾向于并且有可能只存在于在Parvo生物群菌株中。

泌尿生殖道解脲脲支原体感染的分子流行病学研究

目的了解粤东地区泌尿生殖道感染人群中解脲脲支原体的感染及其型别分布。方法用液体选择培养基进行临床标本的初筛,再用PCR法进行分群和分型。结果1 790例临床标本中解脲脲支原体阳性670例(37.43%),对392例阳性培养物进行分群,生物1群阳性率为71.94%;生物2群阳性率为29.85%;对264例单纯生物1群阳性标本进行PCR分型结果血清型1有20例(7.58%),血清型3或14有139例(52.65%),血清型6有51例(19.32%)并有大量混合感染;对99例单纯生物2群感染标本的PCR分型结果,基因型3(血清型7、11)最低,基因型1和2感染率较高。结论粤东地区泌尿生殖道感染人群中,解脲脲支原体以生物1群中的血清型3和血清型6单纯感染为主,但不同血清型或基因型在该地区的分布有一定的特征性。

妇科门诊人群宫颈解脲支原体检出情况及分群分型

目的 调查妇科门诊人群宫颈解脲支原体检出情况及其分群分型。方法 用液体选择培养基初筛妇科体检人群 2 61例 ,初筛阳性的液体培养基用玻璃奶法提取DNA ,再用PCR法进行分群分型。结果 2 61例中UU阳性15 9例 (60 .9% ) ,其中生物一群 15 1例 (95 .0 % ) ,生物二群 8例 (5 .0 % ) ;生物一群中血清 1型 3 0例 (19.9% ) ,血清 3型 62例 (4 1.1% ) ,血清 6型 44例 (2 9.1% ) ,血清 14型 2例 (1.3 % ) ,混合感染 13例 (8.6% )。结论 在妇科门诊人群中UU的检出率达到 60 .9% ,以生物一群为主 (95 .0 % ) ,而且以 1、3、6型单纯感染为主 (90 .1% )。所以妇科门诊人群中单纯从宫颈分离出UU并不意味着致病。

解脲脲原体生物群在生物膜形成能力及生物膜形成后耐药性的差异

目的观察解脲脲原体(Uu)Parvo和T960两大生物群在体外形成生物膜的能力及生物膜形成后药物敏感性的差异。方法以Uu标准株3和8血清型及从21个女性患者宫颈分离出的21株Uu临床株为研究对象。以多条带抗原(MB-Ag)基因为靶位设计分群引物进行Uu生物分群检测。体外培养生物膜后扫描电镜及共聚焦激光显微镜鉴定生物膜形成,结晶紫半定量法检测生物膜形成能力,以微量肉汤稀释法对菌株生物膜形成前后进行药敏测定(四环素,红霉素和环丙沙星)。结果 Uu两生物群均具有生物膜形成能力,在生物膜形态及形成量上无明显差异,生物膜形成后对3种药物的耐药性均增高(P<0.05),但Pavor生物群变化更大。结论 Uu两生物群在生物膜形态及形成量上无明显差异,但形成生物膜后耐药性可能存在差异。

江西省烟草青枯菌生理小种及生化型鉴定

为给江西烟草青枯病抗性品种的选育和利用提供理论依据,对江西主要烟区青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的生理小种和生化型进行了鉴定。从石城、瑞金、会昌、信丰、广昌、峡江6个主要产烟县(市)采集青枯病感病烟株,通过平板稀释分离法从中分离获得24个具有致病性的烟草青枯病菌菌株。选取其中具有代表性的6个菌株,采用鉴别寄主接种、烟叶浸润反应和黑色素产生试验的方法,对其进行生理小种鉴定,结果 6个菌株均属于生理小种1;测定菌株对三种双糖和三种己醇的利用能力以及对硝酸盐还原作用,结果发现6个菌株均属于生化型Ⅲ-1。

云南省烟草上青枯雷尔氏菌的致病力、生化型和致病型研究

为了解云南省烟草上青枯雷尔氏菌的多样性,对分离自云南省6个县烟草病株的菌株进行了致病力、生化型和致病型测定。烤烟品种K326的离体叶片致病力测定结果表明,165个青枯雷尔氏菌株可划分为强、中、弱3种致病力类群,分别占45.4%、46.7%和7.9%,强、中致病力菌株占优势。对其中具代表性的81个菌株的生化型测定结果表明,43个菌株分别属于生化型Ⅲ,占53.1%;32个菌株分别属于生化型Ⅲ-1,占39.5%;6个菌株分别属于生化型Ⅲ-2,占7.4%。对其中55个来自不同采集地点和不同致病力菌株的致病型测定结果表明,弱毒力(Ⅰ)型菌株的比例最高,占63.6%,中毒力(Ⅱ)型菌株的比例其次,占27.3%,强毒力(Ⅲ)型菌株的比例较少,占9.1%。菌株致病型的地理分布存在较大差异。

浙江省桑树青枯病菌生理小种及生化型的测定

从浙江临安、桐庐发生青枯病的桑树的根、茎部分经分离纯化得217个桑树青枯病菌分离物,从217个分离物菌株中选择16个典型菌株进行研究,经离体水培接种试验,表明这些分离物均引起桑枝"凋萎"症状,其形态、大小、染色反应、培养性状与对照番茄青枯菌相近,但生长速度较慢。参照Haywind的标准,这些菌株均为雷尔氏菌的生理小种1,75%为青枯菌的生化型Ⅴ,25%为青枯菌的生化型Ⅲ。

广东省烟草青枯菌的菌系和遗传多样性

从广东省韶关和梅州2个烟草产区采集了来自8个县市的共38个烟草青枯菌菌株,对病菌的生物型、致病型和遗传多样性进行了测定,结果表明广东烟草青枯菌全部为生物型Ⅲ。通过在红花大金元,K326,岩烟97和系3等4个烟草鉴别品种上的致病性反应,将广东烟草青枯菌分为强致病力、中等致病力和弱致病力3种致病型,其中以中等致病力菌株为主,占78.9%;强致病力菌株占13.2%;弱致病力菌株占7.9%。从116个RAPD通用引物中筛选出10条引物,用于对38个烟草青枯菌株DNA的RAPD分析,扩增条带表现出明显的多态性,条带主要聚集在0.3～4.0 kb之间。聚类分析这38个菌株可分为2个组群,即组群A和组群B。组群A中又可以分为7个亚组(A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7);组群B也含有4个亚组(B1、B2、B3、B4)。研究结果还表明,广东烟草青枯菌菌株RAPD组群的划分与菌株的寄主来源有一定的相关性,但与地理区域、生物型和致病型没有明显的相关性;生物型不能反映烟草青枯菌菌系的差异。

泥鳅的凡隆气单胞菌感染

目的2007年9月江苏东海一家泥鳅养殖场的泥鳅发病。病鱼外观症状表现为身体发红,体表有出血点,病情严重者皮肤出现溃疡灶。患病泥鳅死亡率高达60。为弄清此次疾病的发病原因,为预防和治疗该病提供理论依据和参考,对该病的病原进行了研究。方法从患病泥鳅体内分离到1株优势菌株NQ,然后进行人工感染试验。采用传统手工鉴定与API自动鉴定相结合的方式对病原菌株NQ进行生理生化特性的测定;同时对该菌的16SrDNA序列进行分析,构建系统发育树。综合菌株NQ的生理生化特征和16SrDNA序列的分析结果,最终确定该菌的分类地位。结果与结论人工感染试验证实菌株NQ为此次泥鳅发病的致病原,经鉴定为凡隆气单胞菌温和生物型(Aeromonas veronii biovar sobria)。

解脲脲原体生物群分布与耐药性差异研究

目的了解本地区泌尿生殖道感染人群中解脲脲原体感染的生物群分布特点及其耐药情况。方法采用液体选择培养基对泌尿道分泌物标本进行培养、鉴定及药敏;选取解脲脲原体阳性标本进行PCR分群和分型;分析各生物群型别及其耐药性差异。结果 985例检测标本中,单独解脲脲原体阳性395例,总阳性率为40.10%,其中女性368例,男性27例,其阳性率分别为42.45%、22.88%,女性阳性率高于男性,其差异有显著统计学意义(χ2=16.550,P<0.01)。395例单独解脲脲原体阳性标本作PCR分群分型显示,单独生物一群阳性278例,阳性率为70.89%;单独生物二群阳性80例,阳性率为20.25%。单独生物一群中以单一血清6型(121例,43.21%)、3/14型(96例,35.53%)感染为主。单独生物二群均为混合血清型感染,基因亚型1(血清型2、5、8、9)和亚型3(血清型7、11)混合感染(49例,61.25%);基因亚型2(血清型4、10、12、13)和亚型3(血清型7、11)混合感染共检出(31例,38.75%)。结合药敏结果发现,解脲脲原体对喹诺酮类药物耐药率较高,对四环素类药物较敏感,且多重耐药现象严重。生物一群对司帕沙星的耐药性高于生物二群,二者差异有统计学意义(χ2=5.701,P=0.017<0.05),且生物一群对米诺环素、多西环素、阿奇霉素的耐药性远高于生物二群,其差异有显著统计学意义(χ2=10.811,χ2=19.103,χ2=7.541,P均<0.01)。进一步结合分型结果发现,生物一群中单一血清型S6耐药率最高的抗菌药为氧氟沙星(76.86%),S1型耐药率最高的抗菌药为罗红霉素(95.74%),S3/14型耐药率最高的抗菌药为罗红霉素和阿奇霉素(均为86.46%)。结论泌尿生殖道感染人群中解脲脲原体阳性率较高,女性高于男性,以生物一群单一血清型感染为主;本地区耐药形势严峻,生物一群耐药性高于生物二群;生物一群中各血清型的耐药性存在不同程度的差异。结合解脲脲原体生物分群分型结果可辅助合理选用抗菌药物,以避免滥用致耐药株产生。

女性下生殖道解脲脲原体生物群与临床症状相关性初步探讨

目的探讨女性下生殖道解脲脲原体(Uu)不同生物群与临床症状及体征的相关性。方法收集本院性病门诊就诊的女性患者宫颈分泌物Uu临床标本,并登记就诊者的相关症状,以多条带抗原(MB-Ag)基因为靶位设计分群引物进行Uu生物分群检测。结果共收集132株Uu,其中Parvo生物群占74.24%,T960生物群占25.76%。未检测到Uu混合感染的标本。86例就诊者存在一种或多种临床症状或体征,其中Parvo生物群59例,T960生物群27例,T960生物群感染者更偏向于具有临床症状或体征者(P<0.05)。结论Parvo生物群是女性下生殖道感染Uu中的优势菌群,T960生物群更容易引起临床相关症状或体征。

解脲脲原体生物群与体外抗菌药物敏感性关系的初步研究

目的探讨解脲脲原体两大生物群与体外抗菌药物敏感性的相关性。方法采用微量肉汤稀释法测定体外抗菌药物敏感性,并以多条带抗原(MB-Ag)基因为靶位,设计分群引物,对UU菌株进行分群。结果两大生物群对五种抗菌药物MIC值范围基本一致,个别MIC90值存在差异。UU两大生物群对四环素、多西环素、洛美沙星的耐药率差异无显著性意义,但对红霉素、阿奇霉素耐药率差异有统计学意义(P分别为0.0008和<0.0001)。结论UU两大生物群对抗菌药物的耐药性可能存在差异,支持UU分成两个独立的物种。