Metabolites of A Novel Antibiotic Bitespiramycin in Rat Urine and Bile

A sensitive analytical method to identify active metabolites of bitespiramycin in rat urine and bile was developed by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC/ESI-MSn). Bitespiramycin and its major active metabolites in rat urine and bile were isolated and identified as Ml serial (spiramycin Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ), M2 serial (platenomycin Al, josamycin and leucomycin Al) and M3 serial (deisovalerylplatenomycin Al, deisovaleryl-josamycin, deisovalerylleucomycin Al).

新一代必特螺旋霉素基因工程菌的微波诱变

本文探讨微波诱变对新一代必特螺旋霉素基因工程菌的育种效果。以经紫外诱变筛选的新一代必特螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticusNBT-U149为出发菌株进行微波诱变筛选。辐射分四种方式:培养皿加盖冷却;加盖不冷却;不加盖冷却;不加盖不冷却,辐射时间分别为10、20、30、40、50、60、80、100和120 s。每次辐射5 s后,冰上快速冷却20 s再照射,并将照射时间累计。以不同的辐射时间设定为不同的微波处理剂量,计算致死率。结果表明,必特菌株对微波敏感,微波辐射60 s时致死率达到92.55%。微波诱变在以脉冲频率为2450MHz的800W家用微波炉条件下,其最佳作用方式为培养皿不加盖、冰上快速冷却,最佳辐射时间为50 s。初筛摇瓶正突变率达到57.14%,复筛摇瓶发酵效价是出发菌株1.6倍以上的有10株,占初筛菌株的2%。最终筛选得到突变株Streptomyces spiramyceticusNBT-UM22,其必特螺旋霉素发酵产量是出发菌株的1.87倍,且组分比例无明显变化。

铵离子对必特螺旋霉素生物合成的调控

研究了在复合培养基中发酵生产必特螺旋霉素时,铵离子浓度对发酵组分的影响。从发酵24 h开始,每12 h补加3.2 mmol/L的铵离子,考察其对必特螺旋霉素中异戊酰螺旋霉素组分和异戊酰基螺旋霉素Ⅲ/Ⅱ的调节作用。实验结果表明:在降低基础培养基铵离子浓度的基础上,补加铵离子可以明显改善必特螺旋霉素组分,生物效价达2 200 u/mL。通过测定发酵过程中还原糖、相关有机酸、琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)活性、缬氨酸脱氢酶(Valine dehy-drogenase,VDH)活性等中间代谢数据,对铵离子的作用原理进行了讨论。

响应面法优化必特螺旋霉素发酵培养基

目的利用响应面法对新一代必特螺旋霉素基因工程菌(Streptomyces spiramyceticus,WSJ-2),即含有整合型双拷贝4″位异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleryltrasferase gene,ist)工程菌发酵培养基进行优化。方法以发酵效价和异戊酰螺旋霉素组分含量为指标,通过部分因子析因设计实验,筛选出影响较大的主要影响因子。其次,进行最陡爬坡实验,最后,通过中心组合设计,利用DX7trail 7.0软件进行回归分析,确定主要影响因子的最佳浓度,得到优化发酵培养基。结果综合培养基组成对发酵效价和组分含量的影响获得2个主要影响因子,即KH2PO4和NaCl,通过最陡爬坡实验和响应面法,确定了优化发酵培养基组成为(g.L-1):淀粉60、碳酸钙7.0、MgSO42.0、NH4NO36.0、酵母粉3.0、鱼粉15、MnCl20.10、NaCl 12.5、KH2PO40.645。验证实验表明在优化培养基中发酵相对效价为142%与预测值139%比较接近,效价比原配方提高了42%,而其总异戊酰基螺旋霉素组分的含量与原配方基本一致。结论对新构建的必特螺旋霉素基因工程菌采用响应面中心组合设计,可以较有效地进行发酵培养基的优化。

液相色谱-质谱联用法鉴定必特螺旋霉素中多组分

采用 Kromasil C18色谱柱 ( 5μm粒径 ,2 0 0× 4.6mm内径 ) ,流动相为乙腈 -1 0 mmol/ L乙酸铵溶液 ( V(乙腈 )∶V(乙酸铵 ) =60∶ 45 ) ,建立快速分析抗生素新药必特螺旋霉素中复杂多组分的分析方法。采用电喷雾离子化源 ,以正离子检测方式进行一级、二级全扫描质谱分析。研究表明 :其中含有 1 0种螺旋霉素类衍生物并推断出化学结构 ,通过与对照品的色谱和质谱行为对比得到验证。采用液相色谱 -质谱联用技术 ( LC-MSn)可以快速阐明复杂多组分抗生素新药必特螺旋霉素类的化学组成 ,并且可以作为一种简单、便捷的分析方法对大环内酯类新抗生素进行高通量筛选。

必特螺旋霉素在大孔树脂HZ820上的吸附动力学研究

在本文中,采用大孔吸附树脂HZ820从水溶液中吸附分离必特螺旋霉素。吸附速率是吸附实验设计中一个很重要的参数。本文以吸附温度,离子强度为考察参数,利用间歇吸附实验,获得必特螺旋霉素在HZ820上的吸附动力学数据和热力学数据。使用准一级方程(pseudo-first-order)、准二级方程(pseudo-second-order)、Freundlich动力学方程、空隙扩散模型(porediffusion model)和Elovich方程5种模型对实验动力学数据进行拟合,并分析对比了拟合结果。结果表明,准二级方程对实验数据的拟合具有最高的相关度,并根据对比结果判断该吸附系统为非均相吸附过程,吸附速率由液膜扩散速率和孔内扩散速率综合控制。Langmuir和Freundlich吸附等温线方程均较好地描述了必特螺旋霉素在HZ820树脂上的吸附相平衡关系。该吸附过程为优惠吸附过程,提高温度和增大离子强度均有利吸附的进行。

高效液相色谱法测定必特螺旋霉素发酵液中有机酸

必特螺旋霉素是运用基因工程技术获得的工程菌产生的一组以异戊酰螺旋霉素为主要成分的多组分新型抗生素,其前体为乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸等有机酸。本研究利用高效液相色谱法以0.01 mol/L磷酸缓冲液(pH2.3)和甲醇为流动相,分别在反相C_8(α-酮戊二酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸)和C_(18)(丁酸、异戊酸)柱上定量测定了必特螺旋霉素前体酸和三羧酸循环相关有机酸。所建立的测定方法的相对标准偏差为0.10%～0.42%,回收率为93.19%～102.08%。

亮氨酸对必特螺旋霉素发酵组分的影响

本文针对必特螺旋霉素发酵主要组分异戊酰基螺旋霉素以及异戊酰基螺旋霉素Ⅲ的提高,在摇瓶培养基试验中,通过一次性添加与分批添加终浓度为15.4mmol/L的亮氨酸,发现分批添加亮氨酸可以维持效价基本不变,而总异戊酰基螺旋霉素与异戊酰基螺旋霉素Ⅲ分别由对照的31.1%和12.0%提高至46.9%和19.5%。通过分析发酵过程的有机酸以及氨基酸的变化规律,讨论了亮氨酸提高必特螺旋霉素主要组分的作用机理,同时在15L发酵罐中对分批添加亮氨酸添加效果进行了验证试验,结果表明,发酵液必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素和异戊酰基螺旋霉素Ⅲ在96h分别提高至59.91%和21.45%。

异戊酰螺旋霉素Ⅱ和Ⅲ的竞争吸附数学模型研究

采用竞争吸附法分离异戊酰螺旋霉素Ⅱ和Ⅲ。分别采用扩展Langmuir、扩展Langmuir-Freundlich和扩展Jovanovic-Freundlich模型拟合了稀溶液中异戊酰螺旋霉素Ⅱ和Ⅲ在HZ820上的竞争吸附热力学行为。其中扩展Jovanovic-Langmuir模型取得了最好的结果。并研究了温度和pH值对HZ820吸附异戊酰螺旋霉素Ⅱ和Ⅲ的吸附量和选择性的影响,实验表明:提高温度利于异戊酰螺旋霉素Ⅱ和Ⅲ在HZ820上吸附量的增大和选择性的提高,而提高pH值利于增大异戊酰螺旋霉素Ⅱ和Ⅲ在HZ820上的吸附量,而选择性则在pH值接近6.5时趋于最大值。

利用强启动子PermE^＊提高4＂-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中对螺旋霉素的4＂-异戊酰化水平

目的提高螺旋霉素生物转化为4"-异戊酰螺旋霉素的水平,为构建以4"-异戊酰螺旋霉素为主要组分的必特螺旋霉素新一代基因工程菌提供指导。方法构建重组质粒pKC1139-e-ist-ist和pKC1139-ist-ist,它们分别含有5'-上游插入红霉素抗性基因强启动子PermE*的4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝,和4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝;将它们分别导入到变铅青链霉菌TK24中,比较它们对螺旋霉素的4"-异戊酰化能力。结果在加入终浓度为50μg/mL螺旋霉素时,变铅青链霉菌TK24[pKC1139-e-ist-ist]比变铅青链霉菌TK24[pKC1139-ist-ist]对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平提高近4倍。结论在变铅青链霉菌TK24中,PermE*可以增强4"-异戊酰基转移酶基因表达,明显提高对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平。

必特螺旋霉素萃取过程研究

从热力学角度考察了温度、pH值、NaH2PO4质量分数对不同溶剂体系中必特螺旋霉素溶解度的影响,研究了磷酸盐缓冲液萃取石油醚洗脱液中必特螺旋霉素过程工艺特性,详细考察了温度、pH值、NaH2PO4质量分数等诸因素对萃取过程分配系数α的影响。萃取实验选择H3PO4-质量分数0.7%NaH2PO4缓冲溶液为萃取剂,以A/O相比=1/10进行萃取。研究发现:萃取过程最佳pH值范围为2.0—2.2,萃取分配系数α随着温度的升高而变小,萃取过程为放热过程,低温与较高的NaH2PO4质量分数有利于萃取过程的进行。在实验基础上推导并建立了萃取分配系数α与pH值及温度T函数关系α-pH及α-T理论数学模型,并用Matlab软件拟合得到α-pH-T函数关系式。

分离纯化过程中温度和pH对必特螺旋霉素稳定性的影响

考察了不同温度下必特螺旋霉素在磷酸盐缓冲液和发酵液中的稳定性,以及在碱作用下必特螺旋霉素于水酯两相中的稳定性,并分析水相pH对其组分的影响。结果表明,必特螺旋霉素对热稳定;对pH敏感,最适范围为pH4.5～7.5;水酯两相接触时,必特螺旋霉素在碱的作用下易降解,因此萃取和静置分层应在1h内完成。

必特螺旋霉素的工业结晶过程

以未知杂质为考察的着重点,探索了25℃下必特螺旋霉素最佳结晶时的pH以及同一pH下温度对工业结晶的影响。利用高效液相色谱对结晶产品进行检测,并用外标法对必特螺旋霉素中各部分杂质进行了详细的分析,通过对比结晶过程有效组分和总未知杂质对螺旋霉素的选择性系数,在兼顾有效组分含量合格和杂质质量分数最低的前提下,确定最优结晶终点pH为7.5~8.0,最优结晶温度为25~35℃。该方法首次以未知杂质的含量变化来探索必特螺旋霉素结晶的规律,工业上便于实施,有利于指导工业生产。

HPLC法分析可利霉素的组分

可利霉素（kelimycin）又称必特螺旋霉素（bitespiramycin）、生技霉素（shengjimycin）是利用基因工程技术将碳霉素4″-异戊酰转移酶（4″-O-acyl-transferase）基因克隆到螺旋霉素产生菌中，

必特螺旋霉素的萃取特性及杂质的选择性分离

在必特螺旋霉素萃取过程中,考察了萃取时间、水酯相比和pH值对必特螺旋霉素各组分以及弱极性杂质分离的影响,并分析了异戊酰螺旋霉素Ⅲ和弱极性杂质的分配系数。结果表明,两者的分配系数随pH值的增大而逐渐趋于零;调节萃取pH值为4.4,弱极性杂质的去除率为40.6%,同时异戊酰螺旋霉素Ⅲ含量大于30%。

4″-异戊酰基转移酶基因重组质粒构建及其异源表达

目的:通过构建重组质粒,异源表达4″-异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleyltrasferase gene,ist)生产螺旋霉素。方法:在螺旋霉素的4″位加上异戊酰基侧链从而获得基因药物必特螺旋霉素基因。结果:研究表明acyB2基因是ist的正调控基因,ist基因与acyB2基因构建的ist-acyB2共表达质粒不能在变铅青链霉菌TK24中表达。启动区点突变的回复表明770bp到780bp之间有一碱基由原来的A回复成G。结论:经测序研究后发现在ist的启动区产生了一个点突变,拟回复此突变之后重新构建新的ist-acyB2载体,可用于检测ist基因在异源宿主中的表达情况。