奶牛养殖场环境中耐药基因bla_(NDM)的分布和传播特性分析

目的:了解奶牛养殖场环境中耐药基因bla_(NDM)的分布情况及传播特性。方法:采用PCR法从河南省焦作市某地2个奶牛养殖场的奶牛养殖场饲养环境、动物(鼻拭子、粪便)和工人(咽拭子、粪便)样本中检测并分离bla_(NDM)阳性菌株,对bla_(NDM)基因阳性大肠杆菌进行系统进化群、多位点序列分型、耐药表型和耐药基因分析;通过接合试验验证bla_(NDM)基因的可转移性;质粒稳定性试验分析携带bla_(NDM)基因的质粒在宿主细菌中的稳定性。结果:bla_(NDM)基因在奶牛场的总检出率为35.5%,成年母牛中bla_(NDM)基因的阳性检出率高于犊牛(P<0.001),从动物和工人粪便共分离出17株bla_(NDM-5)阳性大肠杆菌,bla_(NDM-5)阳性大肠杆菌属于系统进化群A群(11.8%)和B1群(88.2%),存在3种不同ST型(ST_(48)、ST_(n-1)、ST_(n-2))。17株bla_(NDM-5)阳性大肠杆菌均是多耐药菌株。所有菌株的bla_(NDM)基因位于接合性质粒,可以通过质粒接合转移至受体菌株中,且经过36代无抗培养后仍能在宿主细菌中稳定存在。结论:bla_(NDM)基因在奶牛养殖场流行率较高,主要的细菌宿主是大肠杆菌,且bla_(NDM)基因可通过质粒的接合转移进行水平传播。

携带bla_(NDM-1)基因革兰阴性杆菌的分子流行病学研究

目的了解临床分离碳青霉烯类不敏感革兰阴性杆菌中bla_(NDM-1)基因的分布,探讨NDM-1阳性菌株的分子流行病学特征。方法收集长沙地区2011年1月—2012年8月临床分离非重复碳青霉烯类不敏感革兰阴性杆菌,聚合酶链反应(PCR)技术筛查bla_(NDM-1)基因,扩增产物测序和BLAST软件分析。对bla_(NDM-1)基因阳性菌株,采用E试验法检测其药物敏感性、PCR法检测β内酰胺酶基因(包括bla_(DHA)、bla_(VIM)、bla_(IMP)、bla_(GIM)、bla_(CTX-M)、bla_(KPC)、bla_(TEM)和bla_(SHV)等)和16S r RNA甲基化酶基因、脉冲场凝胶电泳(PFGE)及多位点序列分型(MLST)技术进行分子生物学分型。结果共收集到687株碳青霉烯类不敏感的革兰阴性杆菌,其中3株被证实为bla_(NDM-1)基因阳性菌株,包括2株肺炎克雷伯菌(菌株编号CS11495和CS610)和1株阴沟肠杆菌(菌株编号CS30754)。该3株菌均来源于湘雅医院。在测试的12种抗菌药物中,除对阿米卡星和多黏菌素B敏感外,对其余抗菌药物几乎全耐药。菌株CS11495同时检出bla_(SHV-12)、bla_(TEM-1)、bla_(CTX-M-15)和bla_(IMP-4),菌株CS610携带bla_(DHA)、bla_(SHV-12)和bla_(TEM-1),菌株CS30754中bla_(SHV-12)和bla_(TEM-1)基因阳性。其余基因均为阴性。2株肺炎克雷伯菌PFGE分型可分为A、B两型。MLST显示,菌株CS11495、CS610和CS30754分别属于ST629、ST490及ST214,其中ST490为国内首次报道。结论 bla_(NDM-1)阳性菌株具有广泛的耐药谱,与其同时携带多种耐药基因有关。尽管本地区不存在克隆传播,但分布于同一医院的不同科室,应预防其播散。

携带bla_(NDM-1)碳青霉烯类耐药雷极普罗威登斯菌耐药机制研究

目的研究碳青霉烯类耐药雷极普罗威登斯菌的耐药表型、耐药机制、传播方式及同源性。方法对分离自重症监护病房(ICU)的17株雷极普罗威登斯菌进行药物敏感性试验、耐药基因筛选、NP试验、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、质粒可移动性及复制子分型分析。结果 17株雷极普罗威登斯菌均携带碳青霉烯类耐药基因bla_(NDM-1)。对厄他培南、美罗培南、亚胺培南、头孢唑林、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢美唑、哌拉西林、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、环丙沙星、呋喃妥因的耐药率为100.00%,对哌拉西林-他唑巴坦、氨曲南的耐药率为88.23%。PFGE同源性分析显示17株雷极普罗威登斯菌中有15株为ICU主要流行株;质粒分析显示bla_(NDM-1)存在于～160 kb接合性质粒上,复制子Inc分型为A/C型,质粒携带多种耐药基因,除对环丙沙星和呋喃妥因敏感外,介导对碳青霉烯类、头孢类、头霉素类、磺胺类和氨基糖苷类抗菌药物高水平耐药。结论携带bla_(NDM-1)的雷极普罗威登斯菌多重耐药,临床抗感染治疗难度较大。

大肠埃希菌质粒介导的blaNDM-1基因耐药及传播性研究

目的探讨某院携带blaNDM-1基因大肠埃希菌的流行现况及传播机制。方法收集2016年1-12月南昌大学某附属医院对碳青霉烯类抗生素不敏感的大肠埃希菌92株,对其进行blaNDM-1基因筛查,并对blaNDM-1基因阳性的大肠埃希菌进行其他常见碳青霉烯酶基因检测。将blaNDM-1基因阳性的大肠埃希菌(供体菌)与大肠埃希菌J53(受体菌)进行接合试验,采用药敏试验及mCIM试验对接合子进行表型验证,提取供体菌及接合子的质粒采用Southern blot技术对blaNDM-1基因进行基因定位,并验证其水平转移的能力。结果在对碳青霉类抗生素不敏感的92株大肠埃希菌中发现2株携带blaNDM-1基因,携带率2.2%。此2株大肠埃希菌未发现同时携带其他常见碳青霉烯酶基因。接合试验及Southern blot发现此2株大肠埃希菌的blaNDM-1基因均位于菌株的质粒上,且有1株大肠埃希菌的blaNDM-1基因可以通过质粒向大肠埃希菌J53转移。药敏试验结果显示,此2株大肠埃希菌对临床使用的多种抗菌药物耐药,且接合子获得了与供体菌相似的药敏结果。mCIM试验表明,此2株大肠埃希菌及接合子均产NDM-1型碳青霉烯酶。结论该院存在携带blaNDM-1基因而产NDM-1型碳青霉烯酶的大肠埃希菌,携带blaNDM-1基因的大肠埃希菌对临床使用的大多数抗菌药物耐药,质粒可介导blaNDM-1基因的水平传播。

超级细菌bla NDM-1和mcr-1基因双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立可同时检测超级细菌bla NDM-1基因和mcr-1基因的快速检测方法,针对bla NDM-1基因和mcr-1基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,以构建含有bla NDM-1基因和mcr-1基因片段的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各种反应条件,建立同时检测bla NDM-1基因和mcr-1基因的双重荧光定量PCR方法。该方法能够特异性扩增bla NDM-1基因和mcr-1基因质粒标准品,而对照标准菌株的检测结果均为阴性。两种质粒标准品的检出下限均为1.63×101拷贝/μL,比常规PCR敏感性高100倍;组内和组间重复试验的变异系数均小于2%。应用所建立的方法对55株鸡源致病性沙门氏菌、10株生鲜畜禽产品源大肠杆菌临床分离株进行检测,未发现携带bla NDM-1基因和mcr-1基因的沙门氏菌分离株,发现2株携带bla NDM-1基因和1株携带mcr-1基因的大肠杆菌分离株。结果表明,本研究所建立的双重荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,为bla NDM-1基因和mcr-1基因的快速检测提供了有效的技术手段。