2021年苏州市新报告HIV-1感染者抗病毒治疗前耐药及亚型分析

目的了解苏州市新报告HIV-1感染者抗病毒治疗前耐药以及耐药位点突变情况。方法选取苏州市2021年新报告的HIV-1感染者780例,治疗前采集全血样本,提取血浆中的HIV-1病毒RNA,经反转录、巢式PCR扩增HIV-1 pol区基因后,进行sanger测序和基因型鉴定,并上传至斯坦福耐药数据库进行耐药分析。结果780例样本中成功扩增691例,基因型以CRF07_BC(占38.4%)及CRF01_AE亚型(占35.6%)为主,发生不同程度耐药突变53例,治疗前总耐药率为7.7%,对核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)、蛋白酶抑制剂(PIs)耐药率分别为0.4%、5.1%、2.7%。不同婚姻状况(χ^(2)=10.55,P<0.05)、不同HIV-1亚型(Fisher's精确检验,P<0.05)患者耐药率差异均有统计学意义。691例成功扩增样本中检测到耐药突变位点19种,对PIs、NRTIs、NNRTIs区耐药基因突变占比分别为3.5%、0.7%、18.4%;PIs突变频率最高位点为Q58E(60.0%),NNRTIs为V179D/E/T(64.9%),NRTIs区少数出现M41L、L210W以及T215S等耐药位点突变。结论2021年苏州市新报告HIV-1感染者治疗前耐药率较高,应加强耐药监测,及时调整抗病毒治疗方案,减少耐药病毒株的产生及传播。

两株阴沟肠杆菌的DHA-1型耐药基因的转移方式探讨

目的 通过确定编码AmpC酶DHA 1型基因是存在于整合子还是质粒上 ,来探讨此类AmpC酶的播散方式。方法 分别提取细菌的染色体DNA和质粒DNA通过斑点杂交的方式 ,并将整合子聚合酶链反应(PCR)产物测序 ,来确定编码AmpC酶DHA 1型基因存在的位置。 结果 2株阴沟肠杆菌的斑点杂交试验均在质粒DNA中发现AmpC酶DHA 1型基因 ,而染色体DNA和整合子片断中未找到相关基因。 结论 这 2株阴沟肠杆菌的AmpC酶DHA 1型的基因均存在于质粒上 ,说明他们的AmpC酶是通过质粒的转移而散播的。

HIV-1整合酶基因序列分析方法验证

目的 验证实验室自建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)整合酶基因序列分析方法。该方法可用于评估HIV-1整合酶区段基因型耐药水平。方法 根据世界卫生组织自建基因序列分析方法验证的建议,从20份HIV-1阳性样本中提取RNA,扩增HIV-1整合酶区基因片段,并测序。通过与病毒质量保证(VQA)共识进行比对,评估实验室自建的HIV-1整合酶基因序列分析方案的准确性,通过扩增成功率评估其灵敏度,通过同一样本的重复检测结果评估其精密度和重现性。结果 20份样本与VQA共识的核苷酸一致率均>98%;10个高病毒载量(>10 000拷贝·mL^(-1))样本和5个低病毒载量(1 000~5 000拷贝·mL^(-1))样本的扩增成功率均为100%;4个样本的同批次5复孔和5个样本5次检测的结果均符合90%的样本配对比较核苷酸一致率>98%的要求。结论 该HIV-1整合酶基因序列分析方法的准确性、灵敏度、精密度和重现性均符合要求,适用于HIV-1整合酶基因序列分析。

自愿咨询检测门诊HIV-1新发现感染者治疗前耐药特征和亚型分布

目的了解主动咨询检测的新发现感染者HIV-1耐药株传播水平和亚型分布,探讨该人群治疗前耐药特征。方法为某自愿咨询检测(VCT)门诊报病的HIV-1感染者中主动要求耐药检测的新发现感染者提供检测服务。所有样本分离血浆,提取病毒RNA,采用RT-PCR和巢式PCR扩增HIV-1 pol区片段,并提交斯坦福耐药数据库,得到治疗前耐药和传播性耐药情况。以MEGA 11比对序列并构建进化树,得到序列亚型。结果共纳入新发现HIV感染者61人,均为男性;年龄35岁以下占73.77%,同性性传播占93.44%;职业以商业服务为主,占68.85%,其次是学生,占14.75%。61人中59人成功扩增目的序列,治疗前耐药率为20.33%,传播性耐药率为1.69%。亚型分布以CRF01_AE为主,占54.24%,其次是CRF07_BC,占32.20%;CRF55_01B、CRF67_BC、CRF68_BC均有发现。其中4条55_01B均检测出耐药株,占总亚型的6.78%,位居第一。结论VCT门诊有利于感染者早发现、早诊断,门诊新发现HIV-1感染者治疗前耐药率较高,应重视治疗前耐药检测,以便制定合适的治疗方案,保证治疗成功率。

多药耐药基因MDR1 C3435T多态性与口服环孢素A清除率的关系

的 探讨多药耐药基因 (MDR1 ) 2 6外显子C3435T多态性与环孢素A(CsA)药动学特性间的关系。方法 HPLC法测定 2 0名健康男性单次口服CsA 5 0 0mg后 2 4h中不同时间点的药物浓度。C3435T的多态性测定采用DNA限制性片段长度多态性法 ,并用基因测序法验证。结果 2 0名健康男性志愿者中 ,5例为CC型 ,1 1例为CT型 ,4例为TT型。CC型、CT型和TT型的cmax分别为 (2 1 2 4 .4± 1 79.4 )ng/mL、(1 934.3±372 .8)ng/mL和 (1 76 5 .3± 4 1 6 .0 )ng/mL ;AUC0 inf分别为 (1 392 2 .2± 2 881 .9)ng·h/mL、(1 1 5 1 1 .8± 2 1 92 .1 )ng·h/mL和 (85 1 5 .3± 1 0 6 2 .3)ng·h/mL ;CL/F分别为 (37.0± 6 .5 )L/h、(45 .0± 9.0 )L/h和 (5 9.5± 8.1 )L/h ;至少含有一个C等位基因的基因型 (CC和CT型 )与TT型相比 ,cmax和AUC0 inf分别高了 1 5 %和 4 9%,CL/F低了 31 %。C3435T的基因多态性与cmax无相关性 (P >0 .0 5 ) ,而与CL/F和AUC0 inf有关 (P =0 .0 1 3)。结论 MDR1C3435T的多态性是口服CsA生物利用度变异大的影响因素。

上海地区人类免疫缺陷病毒1型感染／艾滋病患者病毒耐药基因突变及亚型分布

目的研究上海地区人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染／艾滋病(AIDS)患者中HIV-1耐药株出现的情况及亚型分布。方法对33例HIV-1感染／AIDS患者的血浆HIV-1分离株,进行抗HIV-1药物(核苷类反转录酶抑制剂、非核苷类反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)的基因型耐药检测和亚型分析。结果33例的HIV-1均未检出对PI的耐药突变;10例高效抗反转录病毒疗法(HAART)治疗失败或抑制病毒复制不完全者中,检出的耐药突变为70％,过渡型耐药突变为20％;23例未经抗HIV-1治疗者中,耐药突变为4．3％,过渡型耐药突变为13％。所有过渡型耐药突变均为T215S。15例经血制品传播的HIV- 1均为B亚型;18例经吸毒和性传播的HIV-1中,B和CRF01-AE亚型分别为39％,和33％,此外,还有C、D、G、K和CRF02-AG亚型。结论上海地区HIV-1感染／AIDS患者中,HAART治疗失败或复制抑制不完全者HIV-1的NRTI和NNRTI耐药突变率高;吸毒和性传播者的HIV-1中,除主要为B和CRF01-AE亚型外,尚有其他少见的亚型。

广西贵港市商业异性性传播人群HIV-1基因型耐药分析

目的分析贵港市经商业异性性传播途径感染HIV-1患者的耐药情况及其影响因素,为艾滋病防控提供科学依据。方法于2018年6—12月,采用方便抽样方法收集319例经商业异性性行为感染的HIV患者资料并采集血液,提取血浆HIV-1 RNA,PCR扩增pol区序列并测序,应用美国斯坦福大学的HIV耐药数据库进行基因型耐药分析。采用多因素logistic回归模型分析耐药发生的影响因素。结果总耐药率为9.09%(29/319),传播性耐药率为5.00%(5/100),获得性耐药率为10.96%(24/219)。29例耐药病例中以高度耐药水平为主(48.28%)。全部观察病例中蛋白酶抑制剂(PIs)、核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)、NRTIs+NNRTIs耐药率分别为0.31%、1.25%、4.39%和3.31%;主要突变位点有M184I/V、M230I和T50L。多因素logistic回归模型分析显示,年龄>60岁是耐药发生的保护因素(OR=0.11,95%CI:0.02-0.62,P=0.01)。结论广西贵港市商业异性性传播HIV感染者耐药率总体处于中等水平,耐药发生受年龄因素的影响。应加强年龄较轻者依从性教育及监测耐药的发生,提高抗病毒治疗效果及预防耐药毒株的发生和传播。

NPHS1基因突变致儿童激素耐药型肾病综合征1例报道

本研究报道了1例激素耐药型肾病综合征(steroid-resistant nephrotic syndrome, SRNS)患儿,总结了患儿的症状、体征、主要辅助检查结果及治疗反应,并对其进行病理检查及肾脏相关致病基因检测。病理结果为局灶节段性肾小球硬化症,基因检测提示患儿NPHS1基因存在复合杂合突变(c.803G>A、c.1339G>A、c.1802G>C),其中c.1339>A、c.1802G>C为致病突变,c.803G>A国内外未见报道。

4种解释系统对HIV-1基因型耐药解释相关性评价

目的:比较HIVDB(7.0.1)、ANRS(25_09/2015)、REGA(9.1.0)和HIV GRADE(12/2015)4种解释系统对HIV-1基因型耐药结果解释的一致性。方法:选取我国3种主要HIV-1流行亚型和流行重组模式(B’、CRF01_AE和CRF07_BC),每种选取200条序列,共600条序列。分别用4种解释系统进行耐药结果分析,分为耐药(R)、中度耐药(I)和敏感(S)3个水平。对4种结果进行统计学分析。结果:4种系统基因型耐药解释结果比较相关性较高(r均>0.57,P均<0.01)。针对亚型来说,CRF07_BC的解释结果相关性最高,其次为B’亚型,CRF01_AE略低。结论:对于我国主要流行的HIV来说,4种解释系统对11种常用的抗病毒治疗药物耐药结果的解释具有较好的一致性。

治疗前血浆和全血干血斑样品HIV-1 Pol区基因型耐药检测结果比较

目的比较治疗前静脉血浆和全血干血斑(DBS)人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)Pol区基因型耐药检测结果的差异,并分析DBS样品用于HIV-1基因型耐药检测的可行性。方法采集44例HIV-1感染者治疗前静脉全血,分别制备全血DBS样品和血浆样品,提取RNA,检测病毒载量。采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增Pol区基因序列,对PCR产物进行Sanger测序,采用Sequencher 5.4.5软件对序列进行清理和拼接,采用BioEdit 7.2软件对参考株序列和样品序列进行比对、系统进化树分析及基因型耐药分析。结果治疗前44例血浆样品检出率100.0%,DBS样品检出30例,检出率为68.2%;24例血浆样品平均病毒载量达到5.02×10^(5)IU/mL,中位数为1.76×10^(5)IU/mL,DBS样品平均病毒载量为1.46×10^(3)IU/mL,中位数为7.95×10^(2)IU/mL;44例患者HIV-1亚型主要为流行重组株(CRF)07-BC(24/44)、CRF01-AE(16/44);血浆和DBS样品序列相似值100%26例(26/30),相似值99%3例(3/30),相似值97%1例(1/30),其中有6例发生不同程度的耐药突变,DBS样品耐药结果与血浆符合率100%,但在其他位点的突变存在差异。结论治疗前全血DBS样品耐药结果及序列与血浆样品具有高度的一致性,全血DBS样品可用于耐药性检测、HIV-1亚型分析,但检出率比血浆低。

1例基因1b型丙肝患者抗病毒治疗失败后发现NS5A耐药相关变异

1临床资料患者,女,51岁,因“乏力半个月”于2018年01月15日入院。既往:基因1b型丙型病毒性肝炎病史20年。辅助检查:肝胆脾CT(平扫+增强)提示肝硬化、脾大,肝脏右叶占位,大小约37 mm×21 mm,局部突向肝外,增强扫描呈“快进快出”方式强化,考虑恶性可能性大,肝门区见结节状软组织影,直径约10 mm,增强扫描明显强化,考虑肝门区淋巴结转移(见图1)。肿瘤标志物:甲胎蛋白1008.07 ng·mL^-1;肝功能:谷丙转氨酶50 U·L^-1、谷草转氨酶40 U·L^-1、总胆红素13.72 mmol·L^-1、直接胆红素2.68 mmol·L^-1、间接胆红素11.04 mmol·L^-1;丙型肝炎病毒(HCV)抗体16.460(阳性>5.00);HCVRNA测定:1.03×10^7 IU·mL^-1。2018年01月17日于吉林大学第二医院肝胆胰外科行腹腔镜下肝部分切除术,术后病理回报(肝)中分化肝细胞肝癌,肝组织有肝硬化样改变(见图2~3)。

基因捕获元件int1和ISCR1在临床菌株中的分布及与细菌耐药性的关系研究

目的研究临床多种细菌中的Ⅰ型整合酶编码基因int1和ISCR1的分布情况,探究其与细菌多药耐药表型的关系。方法收集2011-2012年河北省某医院临床菌株,应用VITEK2COMPACT全自动微生物生化鉴定系统和16SrDNA序列分析进行种属鉴定,利用PCR方法进行int1基因和ISCR1筛查;两种可移动元件的携带情况和菌株的多药耐药表型之间的关系采用卡方检验进行统计计算。结果共收集临床菌株372株,包括325株革兰氏阴性菌和47株革兰氏阳性菌;int1基因和ISCR1在22种(属)175株和18种(属)90株革兰氏阴性细菌中检出,同时在17种(属)71株革兰氏阴性细菌中检出,革兰氏阳性细菌int1基因和ISCR1检测均为阴性;通过对数据分层对比,统计分析发现,在int1基因不存在时,ISCR1的存在与否与菌株是否为多药耐药的关系明显,差异有统计学意义(P<0.01),其存在亦能介导更广泛种类药物耐受,差异亦有统计学意义(P<0.01)。在int1基因存在时,ISCR1的存在能介导更广泛种类药物耐受,差异有统计学意义(P=0.02);在ISCR1不存在时,int1基因的存在与否与菌株是否多药耐药的关系明显,差异有统计学意义(P<0.01),其存在亦能介导更广泛种类药物耐受,差异亦具有统计学意义(P<0.01)。而在ISCR1存在的情况下,上述两种关系不明显。结论基因捕获元件int1基因及ISCR1在革兰氏阴性临床菌株中分布广泛,并与细菌的多重耐药、泛耐药明显相关,特别是ISCR1;应加强可移动元件int1基因或ISCR1流行状况的监测,为其在耐药基因捕获中的作用机制研究和控制多药耐药细菌在临床散播提供可靠的基础数据。

miR-340通过下调CCND1表达增加结直肠癌细胞对5-Fu的耐药

目的:探讨细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的编码基因CCND1 miR-340介导的逆转结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药的机制。方法:采用瞬时转染技术将结直肠癌细胞HCT116、SW480株分别转染si-CCND1和miR340-mimic。应用MTT法检测转染后的结直肠癌细胞对5-Fu敏感性的变化,应用双荧光素酶试验验证CCND1对miR340参与的影响结直肠癌细胞对5-Fu敏感性的影响。结果:瞬时转染si CCND1和过表达miR-340后,结直肠癌HCT116和SW480细胞的IC50值均显著低于对照组(10,10 vs 20μmol/L和20,20 vs 40μmol/L,均P<0.05)。共转染CCND1 3'UTR野生质粒和miR-340 inhibitor的结直肠癌HCT116和SW48细胞荧光素酶的活性显著高于共转染空载体和mimic细胞(P<0.01)。结论:CCND1作为不良因子通过抑制miR340的表达进而发挥增加结直肠癌细胞对5-Fu耐药的作用。

回、汉族癫痫患者ABCB1基因C3435T多态性与癫痫耐药的相关性研究

目的研究ABCB1基因C3435T的单核苷酸多态性在回、汉族癫痫人群中的分布特点;探讨回、汉族癫痫患者人群中ABCB1基因型对癫痫耐药的影响,进一步阐明癫痫耐药机制。方法收集宁夏地区回族癫痫耐药患者33例,回族药物敏感癫痫患者29例,汉族癫痫耐药患者62例,汉族药物敏感癫痫患者61例,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对入选患者的ABCB1基因C3435T位点进行基因分型,并随机抽取11%的基因分型样本进行直接测序证实。统计4组癫痫患者中C3435T的基因型、等位基因频率,分别用2χ等检验进行统计分析。结果回、汉族对照比较,回族癫痫患者中外显子26 C3435T位点基因型及等位基因频率与汉族癫痫患者均没有差异,(均P>0.05)。与药物敏感组比较,耐药组外显子26C3435T-CC基因型明显多于药物敏感组(P<0.001),而TT基因型则少于药物敏感组(P<0.001)。与药物敏感组比较,耐药组C等位基因频率高于药物敏感组,而T等位基因频率低于药物敏感组(P<0.001)。结论在中国回、汉族人群中均存在的ABCB1-C3435T位点基因多态性与癫痫耐药有关联,这一位点的基因多态性可以影响癫痫患者对抗癫痫药物(AEDs)的反应性。

重庆地区汉族人群MDR1基因单核苷酸多态性及单倍型分析

目的:研究重庆地区汉族人群多药耐药基因1(MDR1)C1236T,G2677A/T,C3435T单核苷酸多态性(SNP)及单倍型的频率.方法:采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RELP)方法,对重庆地区196(男112,女84)名没有亲缘关系的汉族健康个体MDR1基因C1236T,G2677T/A,C3435T等3个SNPs位点进行基因分型.用SHEsis软件分析MDR1基因的连锁不平衡及单倍型频率.结果:重庆地区汉族人群中C1236T位点、等位基因频率1236C为33.7%,1236T为66.3%;G2677T/A位点、等位基因频率2677G为44.4%,2677T为43.1%,2677A为12.5%;C3435T位点、等位基因频率3435C为56.4%,3435T为43.6%.重庆地区汉族人群中MDR1基因1236-2677-3435位点构成的3种主要单倍型率(频率>10%)TTT为31.1%,TGC为21.7%,CGC为15.5%.结论:重庆地区汉族人群MDR1基因C1236T,G2677T/A,C3435T等3个SNPs位点的基因型频率、等位基因频率和单倍型频率,为研究该地区MDR1基因单核苷酸多态性与药物效果、药物毒副作用以及疾病易感性之间的相关性提供依据.

HIV-1耐药基因检测的研究进展

HIV-1耐药是影响艾滋病抗病毒治疗效果的主要因素。随着抗病毒疗法的普及和接受治疗者的增多,HIV-1耐药的问题日益凸显,使艾滋病治疗面临巨大的挑战。因此,了解各抗病毒药物治疗引起的HIV-1耐药突变位点并及时采用有效方法进行耐药基因检测对临床治疗具有重要指导意义。HIV-1耐药位点基因型检测方法因其快速准确的特点,目前是HIV-1耐药检测最常用也是最有前景的方法。本文对HIV-1耐药位点和耐药基因检测的研究进展做简单综述。

人类免疫缺陷病毒1型耐药基因的监测

2001年12月在美国举行的第41届ICAAC年会上公布的研究结果显示，美国78％的成人人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者中存在着对一种或多种抗反转录病毒(ARV)药物耐药的病毒株。其中，对核苷类反转录酶抑制剂(NRTI)的耐药率最高，为……

双碱基延伸法结合荧光偏振法快速检测新甲型H1N1耐药位点方法的建立

目的建立一种利用双碱基延伸法与荧光偏振技术(Fluorescence polarization,FP)快速检测甲型H1N1流感病毒NA基因耐药突变位点的新方法。方法从GenBank随机下载30条甲型H1N1的NA(neuraminidase)基因序列,通过MEGA分析,利用Primer Premier软件设计3条特异引物,其中一对引物通过RT-PCR用于扩增含有耐药位点H275Y的NA基因,第3条引物是应用双碱基延伸终止法与荧光偏振技术检测NA基因对达菲类药物耐药位点H275Y的突变情况,再随机选取50株甲型H1N1流感病毒进行检测,与测序结果进行比对,验证检测结果的准确性。结果 50株甲型H1N1流感病毒的NA蛋白第275位氨基酸均为组氨酸,未发生H Y的替换,在灵敏度与特异性方面,与传统的基因测序结果一致性均达100%。结论本方法操作简便、敏感性及特异性高、判读结果直观明确、检测费用低,能实现对耐药位点突变的快速、准确检测,可应用于与SNP相关疾病的快速分型和突变位点的实时监测和临床检测。

基于CRISPR/Cas9点突变技术构建HIV-1基因型耐药检测质控品

目的人外周血淋巴细胞株8E5可分泌无感染性HIV-1病毒颗粒,靶向于8E5细胞株基因组整合的HIV-1前病毒基因POL区,基于CRISPR/Cas9点突变技术构建含有POL区耐药突变位点的单克隆细胞株,可用于制备一种安全稳定的新型HIV-1基因型耐药检测质控品。方法设计构建小向导RNA(single guide RNA,sgRNA)和Cas9共表达载体以及携带有目标突变位点的供体单链寡核苷酸(donor single-stranded oligonucleotides,Donor ssODN)共转染8E5细胞,通过流式微孔板分选获得转染成功的阳性单克隆细胞株,通过Sanger测序确认定点突变的编辑效果。对定点突变编辑成功的单克隆细胞株培养至第3代、5代和7代的细胞及细胞分泌到上清中的HIV病毒颗粒进行Sanger测序,验证定点突变的编辑效果。结果成功构建双sgRNA和Cas9共表达载体,与携带有耐药突变位点Q151M的Donor ssODN共转染8E5细胞株的效果良好。对分选获得的共转染阳性单克隆细胞株进行靶位点测序,结果显示成功构建了携带有定点突变Q151M的纯合子单克隆细胞株8E5Q151M。细胞株8E5Q151M多次传代后的细胞及细胞分泌的无感染性HIV-1病毒颗粒可被持续检测出Q151M突变位点。结论利用CRISPR/Cas9点突变技术成功构建稳定携带有Q151M耐药突变位点的细胞株8E5Q151M,为制备HIV-1基因型耐药检测质控品提供新的技术平台。

RNAi介导IGF-1R基因沉默对非小细胞肺癌PC-9/ZD细胞株EMT的影响

目的探讨RNA干扰(RNAi)介导胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因沉默对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞PC-9/ZD发生上皮—间质转化(EMT)的影响。方法构建靶向IGF-1R基因的RNAi重组慢病毒,感染NSCLC表皮生长因子受体—酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)获得性耐药细胞PC-9/ZD;实时荧光定量PCR法检测IGF-1R表达抑制效应及IGF-1R基因沉默后EMT相关分子的mRNA表达变化,Transwell实验检测细胞侵袭转移能力变化。结果成功构建靶向IGF-1R基因的RNAi重组慢病毒,滴度为1×106TU/μL,对PC-9/ZD细胞IGF-1R基因的mRNA抑制效率为71.4%。IGF-1R基因沉默后,PC-9/ZD细胞形态呈现间质向上皮化转变,上皮标志物E-cadherin的mRNA表达量升高(P<0.05),间质标志物Vimentin的mRNA表达量降低(P<0.05),且侵袭转移能力减弱(P<0.05)。结论靶向IGF-1R基因沉默可逆转PC-9/ZD细胞EMT。