甘蔗宿根矮化病病原菌一推测膜蛋白基因(Lxx18460)单克隆抗体的制备和检测

【目的】对甘蔗宿根矮化病病原菌(Leifsonia xyli subsp.xyli,Lxx)一推测为抗K因子的膜蛋白基因(Lxx18460)进行研究,为今后研究该基因在感病甘蔗体内表达打下基础。【方法】诱导表达并纯化含有推测为抗K因子的膜蛋白Lxx18460基因的p ET-30a质粒菌液,委托南京金斯瑞生物科技有限公司制备单克隆抗体;用Western blotting对细菌及感病和健康甘蔗样品总蛋白进行检测。【结果】Lxx18460基因具有特异性,只存在于甘蔗Lxx中。ELISA单克隆抗体效价大于1∶512000,能够灵敏地检测细菌总蛋白和甘蔗样品蛋白。Western blotting检测结果表明,Lxx18460基因在细菌中和感病甘蔗样品中表达,在健康甘蔗样品中几乎不表达。【结论】Lxx18460基因具有特异性,是Lxx中的抗K因子的膜蛋白基因,能够在细菌和感病甘蔗样品体外进行表达。

ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列转录活性的鉴定

目的检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力,探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测ezrin基因在食管癌细胞EC109、EC171、EC8712、SHEEC,胃癌细胞N87、BGC823,肺癌细胞A549、95D,肝癌细胞HepG2,白血病细胞K562和宫颈癌细胞HeLa中的mRNA和蛋白表达水平;采用PCR法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/+134序列为启动子的真核细胞表达质粒pGLB-hE(-1444/+134);采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/+134序列在EC109、Hela、A549和BGC823细胞中的转录活力。结果ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达,其5′侧翼区-1444/+134序列具有较强的转录活力。结论ezrin基因5′侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用。

中药筋脉通对糖尿病大鼠背根神经节硝基酪氨酸和神经生长因子表达的影响

目的观察中药复方筋脉通(JMT)对糖尿病大鼠背根神经节(DRG)硝基酪氨酸(NT)和神经生长因子(NGF)表达的影响。方法采用链脲佐菌素一次性腹腔内注射方法造模,随机数字表法将大鼠分为正常对照组(Con组)、糖尿病模型对照组(DM组)、JMT治疗组(JMT组)及牛磺酸治疗组(Tau组)4组,每组10只。成模后给予灌胃给药,JMT组[1.31 g/(kg·d),给药剂量为生药量]及Tau组[1.20 g/(kg·d)]均按成人剂量15倍给药,DM组和Con组灌服蒸溜水l ml/(100 g·d)。分别于治疗前及治疗后4、8、12、16周检测各组大鼠体重和血糖变化。所有大鼠均于灌胃16周后进行机械痛阈检测后处死,取大鼠DRG组织,采用免疫组织化学染色法和Western blot法检测大鼠DRG中NT及NGF的表达。结果免疫组织化学检测结果显示,与Con组相比,DM组的NT表达显著升高(P=0.000),NGF的表达显著降低(P=0.006);与DM组相比,JMT组及Tau组的NT表达显著降低(P=0.000,P=0.000),NGF表达显著升高(P=0.000,P=0.004),其中JMT治疗组NT较Tau组更为显著(P=0.004)。Western blot检测结果显示,与Con组相比,DM组的NT蛋白表达显著升高(P=0.000),NGF蛋白表达显著降低(P=0.000);与DM组比较,JMT组与Tau组的NT蛋白表达均显著降低(P=0.001,P=0.000),NGF蛋白表达均显著升高(P=0.000,P=0.001)。结论中药JMT能够增加糖尿病大鼠DRG组织中NGF的表达,同时降低NT水平。

干扰素-γ对单核—巨噬细胞源性泡沫细胞ACAT-1表达的影响

目的观察干扰素-γ对THP-1、THP-1源性巨噬细胞泡沫细胞酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶-1(ACAT-1)表达的影响。方法将THP-1细胞与PMA孵育48小时使之分化为巨噬细胞,继以100mg/mlOx-LDL处理24小时使之形成泡沫细胞。将THP-1细胞、巨噬细胞、泡沫细胞分别用300U/mlIFN-γ干预24小时。RT-PCR检测ACAT-1mRNA水平,WesternBlot检测其蛋白表达。结果THP-1细胞分化成巨噬细胞以及形成泡沫细胞时ACAT-1mRNA及蛋白含量增加(P<0.05),而后两种细胞之间无显著性差异。与各自的对照组相比,经IFN-γ作用后三种细胞ACAT-1mRNA及蛋白表达均增强(P<0.05)。结论IFN-γ诱导单核、巨噬细胞、泡沫细胞ACAT-1的mRNA及蛋白表达,这可能是其促进动脉粥样硬化的机制之一。

羊种布鲁氏菌M5-90 omp31蛋白原核表达

克隆、测序布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白基因OMP31,原核表达OMP31并对其检测。从羊种布鲁氏菌M5-90中PCR获得OMP31基因,连接到pBS-T克隆质粒并测序;将测序正确的基因片段克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a,进行SDS-PAGE,而后Western-blot检测。结果M5-90疫苗株的OMP31基因序列与羊种布鲁氏菌参考株16M的同源性为99.03%;外膜蛋白基因OMP31在大肠杆菌表达后能够被Western-blot检测到。结论:表达的布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白OMP31可以被布鲁氏菌特异性血清识别,表现出良好的抗原性,为以后实验室诊断和疫苗的研究做好坚实的上游工作。

转化生长因子β对大鼠成骨细胞雌激素受体表达的影响

目的探讨转化生长因子β对大鼠成骨细胞雌激素受体表达的影响。方法实验中取雌性SD大鼠4肢松质骨,应用胶原酶消化法得到大量纯净成骨细胞;进行形态学观察,检测不同培养时间的细胞培养液的上清液中成骨细胞特征性分泌物:碱性磷酸酶(AKP)和骨钙素(OCN)的含量;碱性磷酸酶(ALP)染色(改良Gomori氏钙钴法);通过免疫组化法(SP法)进行雌激素受体染色;用不同浓度的TGFβ作用于体外培养的成骨细胞,进行SDSPAGE电泳和Westernblot检测雌激素受体。结果成骨细胞上清液AKP和OCN的分泌量明显高于成纤维细胞(P<0.01),形态学观察符合成骨细胞的特征。经免疫组化染色大鼠的成骨细胞存在雌激素受体,且位于胞核内。Westernblot结果显示,雌激素受体在TGFβ浓度为0.1～0.5ngml时,有较强的荧光发光信号条带。结论TGFβ在浓度为0.1～0.5ngml时,能提高成骨细胞雌激素受体基因表达水平,这可为研究TGFβ对于成骨细胞雌激素受体的作用机制及骨代谢疾病药物筛选提供新的支持。

大鼠重症急性胰腺炎发病机制中p38丝裂原活化蛋白激酶的作用

目的:研究p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号转导通路在大鼠重症急性胰腺炎(SAP)胰腺组织中的变化规律,探讨p38 MAPK特异性抑制剂CNI1493对SAP 的保护作用. 方法:50 g/L牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射建立雄性SD 大鼠SAP模型,随机分为SO组(假手术组,n=30)、SAP—NS组(n=25)及SAP—CNI1493组(n=25),各组大鼠质量相似.Western blot法检测大鼠胰腺组织磷酸化p38 MAPK的表达;ELISA方法检测血清IL-1β,TNF-α水平:光镜下评估胰腺组织病理学积分. 结果:SO组胰腺组织存在磷酸化p38 MAPK弱表达, SAP—NS组造模后15 min时磷酸化p38 MAPK的表达即显著增高至峰值,3 h后开始下降,6 h时磷酸化p38 MAPK活性与SO组相似.SAP—NS组和SAP-CNI1493 组Western blot检测15,30 min条带光密度值5 200±360, 3 500±250和4 910±320,2 500±340,SAP—CNI1493组15,30 min时胰腺组织磷酸化p38 MAPK的表达显著低于SAP—NS组(P<0.01).SAP-CNI1493组3,6 h时间点血清IL-1β,TNF-α水平及3 h时间点胰腺组织病理学积分均显著低于SAP—NS组(P<0.01). 结论:p38 MAPK信号转导通路与牛磺胆酸钠大鼠SAP 发病机制有关,CNI1493预处理可能通过抑制p38 MAPK的激活、减少炎症细胞因子的产生而改善腓炎病理改变的严重程度.

癌基因BMI-1对中心体复制的调节作用

【目的】探讨BMI-1在中心体扩增中的作用。【方法】通过磷酸钙转染法在细胞中高表达野生型、带有Myc-tag的Myc-BMI-1质粒及两个BMI-1的RNAi序列,Westernblot检测BMI-1蛋白的表达,免疫荧光观察中心体数目的变化。【结果】首先检测了抗BMI-1抗体特异识别重组和内源性BMI-1蛋白;高表达BMI-1于HeLa和MCF-7细胞中导致中心体的扩增;在Cos7和U2OS中因RNAi降低BMI-1翻译而抑制了中心体的扩增。【结论】癌基因BMI-1在中心体复制扩增的调节中起着重要的作用。

中华芦荟多糖对辐射后非瘤细胞周期改变及周期相关蛋白表达的影响

目的研究中华芦荟多糖(AP)对X射线照射后人非瘤细胞株C.Liver和293细胞周期进程及细胞周期相关蛋白表达的影响。方法流式细胞仪检测细胞周期,Westernblot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果辐射后293和C.Liver细胞均出现明显的G2/M期阻滞,G0/G1期细胞比例显著下降,50μg/mlAP能显著改变上述趋势。AP预处理能显著下调辐射所致C.Liver细胞P53蛋白水平,显著升高P21、CyclinB1、pRb蛋白的表达,对P27、CDK4和CyclinD1蛋白表达水平无显著影响。结论AP对X射线辐射后非瘤细胞周期紊乱的改善作用与对周期相关蛋白表达的调节有关。

Aβ_(1-15)多价DNA疫苗的构建及其对体液免疫的效果

【目的】构建Aβ1-15多价DNA疫苗,研究其诱导体液免疫的效果。【方法】基因合成和PCR技术扩增以多个甘氨酸连接的Aβ1-15二价基因片段;在N端引物延伸加上IgGκ轻链信号肽序列;GSGGSGlinker再串连两段Aβ1-15二价基因片段,克隆入pcDNA3.1表达载体,构建pcDNA3.1-s4×Aβ15真核表达质粒;质粒转染COS-7细胞,Westernblot检测4×Aβ15的表达;质粒肌肉注射接种BALB/c鼠,共6次,18周加强免疫,ELISA法检测抗体效价以及抗体分型;免疫组织化学和Aβ42肽抗原的中和实验检测抗血清与转基因鼠Tg2576脑切片中老年斑的特异结合。【结果】测序证实所构建的pcDNA3.1-s4×Aβ15载体序列正确,在COS-7细胞中表达分子质量约8ku的分泌型4×Aβ15蛋白。pcDNA3.1-s4×Aβ15疫苗于第2次加强免疫后产生Aβ抗体,随加强免疫次数增多,抗体滴度增加,在19周,抗体平均滴度为1︰6400,抗体以IgG1型为主,且可以与转基因鼠Tg2576脑切片中的老年斑免疫结合并被Aβ42肽抗原的中和。【结论】所构建的pcDNA3.1-s4×Aβ15疫苗可在小鼠体内产生高效价的Aβ抗体,为下一步免疫老年性痴呆转基因动物的研究提供条件。

DR-NM23在浸润性乳腺癌中的表达及与临床病理参数的关系

目的:探讨DR-NM23蛋白在浸润性乳腺癌组织及癌旁组织中的表达及与临床病理参数的关系。方法:选取82例乳腺癌组织,应用免疫组织化学法检测癌组织中DR-NM23蛋白的表达,并分析与临床病理参数的关系;再利用多因素Logistic回归分析进一步确认。利用Western blot检测分析DR-NM23在25例新鲜冰冻的浸润性乳腺癌组织与其对应癌旁组织中的表达。结果:82例乳腺癌组织免疫组化显示DR-NM23蛋白在癌组织及其癌旁组织中阳性表达率分别为25. 61%和85. 37%。乳腺癌组织中DR-NM23蛋白与组织学分级、淋巴转移、TNM分期及雌激素受体表达呈负相关(P <0. 05)。此外,DR-NM23蛋白与年龄、肿瘤大小、PR受体、Her-2受体无明显相关性(P> 0. 05)。利用Western blot法检测显示DR-NM23在癌组织中的平均相对表达量(0. 135 4±0. 024),癌旁组织相对表达量(0. 710 6±0. 091),癌组织中DR-NM23蛋白表达水平明显低于癌旁(P <0. 001)。结论:浸润性乳腺癌组织中DR-NM23蛋白表达明显低于癌旁,且其与组织学分级、淋巴转移、TNM分期及雌激素受体表达呈负相关,提示其在乳癌进展中起到了重要作用,为探索乳癌新靶点提供理论依据。

甲异靛联合imatinib对CML K562细胞的促凋亡作用

目的研究甲异靛联合imatinib促进K562细胞凋亡的作用。方法K562细胞经imatinib或/和甲异靛处理48h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡相关指标(线粒体跨膜电位和AnnexinV/PI)的改变,ELISA方法检测caspase3活性改变,Westernblot检测凋亡相关蛋白(cytC,cIAP1,procaspase3和PARP)的改变。结果与单用组相比,20μmol/L甲异靛与0.3μmol/Limatinib联合应用后,线粒体跨膜电位下降细胞比例明显升高,cytC释放入胞浆,caspase3酶原形式procaspase3减少,caspase3活性升高,其底物PARP被降解,AnnexinV水平升高。结论甲异靛与imatinib合用可协同促进K562细胞凋亡。

维甲酸诱导甲状腺癌细胞摄碘的实验研究

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导甲状腺癌细胞系的钠碘同向转运体(NIS)表达及其碘摄取。方法 通过ATRA诱导甲状腺癌细胞系滤泡状甲状腺癌细胞株(FTC 133)、乳头状甲状腺癌细胞株(W3)及未分化甲状腺癌细胞株( 85 0 5C)后,经逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)及Westernblot检测甲状腺癌细胞系的NISmRNA及其蛋白质表达,并测定甲状腺癌细胞系诱导后的摄碘变化。结果 ATRA诱导甲状腺癌细胞系4 8h后,FTC 133和W3的NISmRNA及蛋白质表达增高,85 0 5C未见变化;ATRA诱导甲状腺癌细胞系2周后,FTC 133和W3的摄碘增高。结论 ATRA能诱导分化型甲状腺癌细胞摄碘增高。

醛糖还原酶(AR)基因对大鼠肾系膜细胞的转染及AR抑制剂对其增殖的影响

目的观察醛糖还原酶(AR)基因转染及AR抑制剂(ARI)对体外培养大鼠肾系膜细胞(MsC)增殖的影响。方法应用Westernblot检测转基因MsC及PDGF作用MsC后AR的表达。四唑蓝比色法(MTT法)检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,对比大鼠正常MsC和转基因MsC的生长情况,并观察ARI———Sorbinil和Zopolrestat对血小板源性生长因子(PDGF)和小牛血清(NBS)促细胞增殖作用的影响。结果①Westernblot鉴定转基因MsCAR表达较正常MsC明显增高;②转染组较正常组生长速度快;③PDGF作用MsC后可上调AR的表达;④PDGF和10%NBS均可显著刺激两组细胞的增殖,ARI可部分抑制PDGF对正常组和转染组的促增殖作用,对10%NBS,ARI可部分抑制其对转染组的促增殖作用,而对正常组无显著影响,抑制作用呈剂量依赖性。结论AR可能参与了MsC在病理状况下的过度增殖过程。

糖尿病大鼠皮肤组织表皮细胞增殖相关事件的研究

目的研究糖尿病大鼠皮肤组织中表皮细胞的增殖改变及其可能机制。方法12只SPF级SD大鼠随机分为糖尿病组(6只)和正常对照组(6只),糖尿病大鼠以STZ诱导。成模后8周,二组同时采集背部皮肤,观察表皮的组织学特征;流式细胞术检测表皮细胞的细胞周期;Westernblot检测细胞增殖调节因子cyclinD1、cyclinB1和cdk4的表达水平,并测定表皮细胞丝裂期促进因子(MPF)的组蛋白激酶活性。结果与正常组相比,糖尿病大鼠表皮结构欠清晰,部分表皮缺乏复层排列,表皮细胞数量明显减少,表皮层厚度明显变薄;S期和G2/M期表皮细胞百分比均显著降低(P<0.01,P<0.05);糖尿病组cdk4的表达水平显著低于正常组(P<0.05),两组间cyclinD1、cyclinB1表达无显著差异(P>0.05);糖尿病组表皮细胞MPF活性显著降低(P<0.01)。结论糖尿病大鼠皮肤表皮细胞处于明显增殖抑制状态,这种增殖抑制可能与cdk4的低表达和MPF活性下降有关。

缺氧诱导因子1α及其相关基因在腹主动脉瘤中的表达

为了研究缺氧诱导因子1α及其相关基因在腹主动脉瘤中的表达,选取腹主动脉瘤标本22例,以5例正常腹主动脉作对照,检测缺氧诱导因子1αmRNA及蛋白的表达,检测血管内皮生长因子及促红细胞生成素的表达及微血管密度。结果发现,腹主动脉瘤组织中缺氧诱导因子1αmRNA及蛋白表达明显高于正常腹主动脉(P<0.01);血管内皮生长因子和促红细胞生成素表达亦明显增强(P<0.01)。缺氧诱导因子1α表达主要分布在腹主动脉瘤中层血管平滑肌细胞及外膜处,与血管内皮生长因子和促红细胞生成素的分布部位基本一致。腹主动脉瘤中微血管密度明显增加(P<0.01)。结果提示,缺氧诱导因子1α在腹主动脉瘤发病过程中可能发挥重要作用。

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人肝癌细胞株乙酰肝素酶表达的影响

目的:探讨乙酰肝素酶(Hpa)反义寡脱氧核苷酸对人肝癌细胞株Hpa mRNA和蛋白表达的影响。方法:设计合成互补于Hpa mRNA起始密码区的硫代反义寡脱氧核苷酸AS-ODN及相应的无义对照寡脱氧核苷酸NS-ODN,以阳离子脂质体Oligofectamine^(TM) Reagent包埋后转染SMMC-7721、BEL-7402细胞,以RT-PCR和Western-blot检测转染前后细胞Hpa mRNA以及蛋白表达的变化。结果:与正常对照组和NS-ODN相应浓度组相比,转染AS-ODN组肝癌细胞Hp amRNA和蛋白的表达均下降。结论:Hpa反义寡脱氧核苷酸下调Hpa mRNA和蛋白的表达,可能抑制肝癌的侵袭转移。

氨基葡萄糖硫酸盐诱导K562细胞凋亡的实验研究

目的 探讨氨基葡萄糖硫酸盐(GS)对慢性髓系白血病K 5 62细胞凋亡诱导作用和分子机理。方法 采用台盼蓝拒染法测定细胞生长曲线来观察GS对K5 62细胞的生长抑制作用;取对数生长期K 5 62细胞,在0 .5 ,1.0 ,5 .0mmol/LGS不同浓度作用48h后,利用细胞计数、电镜、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色、DNA梯状电泳、流式细胞仪等方法来观察GS对K 5 62细胞的抑制效应和促凋亡作用。并用Westernblot检测活化的caspase 3和bcl- 2基因的表达。结果 0 .5 ,1.0 ,5 .0mmol/LGS对K 5 62细胞的生长有抑制作用,并呈时间和剂量依赖性(P <0 .0 1)。采用光镜、电镜和AO /EB染色法发现5mmol/LGS作用K 5 62细胞后,出现典型的凋亡形态学改变。AnnexinV染色后流式细胞仪能检测到早期凋亡细胞,细胞周期显示:G1期细胞比例增高,S期比例减低,并有凋亡峰。有明显的梯状DNA。同时GS诱导K 5 62细胞凋亡后出现活化的Caspase 3 ,而Bcl- 2蛋白表达减弱,甚至消失。结论 GS能诱导白血病K- 5 62细胞凋亡,该过程伴有Caspase- 3的活化和Bcl- 2蛋白表达降低。

低剂量照射对细胞周期和修复基因表达的影响

目的观察低剂量照射对A549(肺癌细胞)和2BS细胞(人胚胎肺成纤维细胞)细胞周期及修复基因表达的影响。探讨肿瘤细胞与正常细胞在诱导修复基因表达方面的差异,并结合细胞周期变化,进一步阐明适应性反应形成机制。方法(1)应用流式细胞技术,对不同剂量照射后A549和2BS细胞周期进行分析;(2)应用Northem-blot检测不同照射剂量DNA修复基因hR24L、hRAD6和hRAD52转录水平的变化。结果(1)2BS细胞经75mGyX线照射组,及低剂量加高剂量照射组于照后30分钟即出现明显的G2期阻滞,且细胞周期于24小时内恢复。A549细胞在75mGyX线照射后,细胞周期未发生变化;(2)2BS细胞在75mGyX照射下,b.R24L、hRAD6表达增强,hRAD52无变化。A549细胞低剂量照射修复基因表达未见显著变化。结论低剂量照射后2BS细胞与A549细胞周期改变存在差异,且细胞周期的调控与DNA修复基因的表达有着密切的关系。