基于网络药理学和大鼠体内验证的藏药红景天改善脑微循环障碍作用机制研究

目的基于文献研究、网络药理学、分子对接与实验验证的方法,探究藏药红景天改善脑微循环障碍的核心靶点、关键成分和作用机制。方法通过文献和数据库收集红景天化学成分,利用反向药效团匹配预测红景天的潜在靶点;获取脑微循环障碍靶点,并与红景天靶点映射,构建交集靶点蛋白互作网络,获取核心靶点;构建“中药-成分-核心靶点-疾病”调控网络并获取关键成分;进行GO和KEGG富集分析,构建“核心靶点-信号通路-生物过程”网络;进行分子对接验证;采用RT-qPCR和Western blot进行动物实验验证,进一步证实网络药理学分析结果。结果从红景天中筛选出76个活性成分和285个靶点,获取脑微循环障碍靶点1074个,交集靶点97个,核心靶点6个,关键成分6个。分子对接结果表明,有3个关键成分与核心靶点的结合性大于核心靶点蛋白与其原始配体结合性。RT-qPCR结果显示红景天能下调核心靶点CASP3、AKT1 mRNA水平,Western blot检测结果显示藏药红景天能降低CASP3、AKT1蛋白表达(P<0.05)。结论藏药红景天可通过多成分、多靶点、多通路协同改善脑微循环障碍,该研究为临床应用藏药红景天治疗脑微循环障碍提供实验依据。

CpOGA^(D298N)与核心链霉亲和素Stv13融合表达用于检测蛋白质O⁃GlcNAc修饰

氧连接的β-N-乙酰葡萄糖胺修饰(O-GlcNAc修饰)是一种发生在蛋白质丝氨酸、苏氨酸羟基上的一种动态、可逆的翻译后修饰。O-GlcNAc修饰在细胞的许多关键过程中发挥重要作用,也是研究阿尔茨海默病和糖尿病等的重要途径,但是常用于O-GlcNAc蛋白检测的抗体特异性或者检测分子量范围仍存在问题且耗时(~36 h)过长,对后续研究造成困扰。在本研究中,我们设计构建了产气荚膜梭菌OGA(O-GlcNAcase)突变体(CpOGA^(D298N))与核心链霉亲和素Stv13融合表达质粒pET28a-CpOGA^(D298N)-Stv13。将质粒pET28a-CpOGA^(D298N)-Stv13转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,获得了融合蛋白质CpOGA^(D298N)-Stv13。通过CpOGA^(D298N)特异性结合O-GlcNAc的能力及生物素-亲和素特异性亲和作用,设计了Far-Western blot(Far-WB)用于检测蛋白质O-GlcNAc修饰,利用sOGT(short form O-GlcNAc transferase)、去O-GlcNAc修饰sOGT、细胞裂解液样本及人肝细胞核因子1A(hepatocyte fuclear factor 1A,HNF1A)对该方法进行验证。本研究成功构建了一种蛋白质O-GlcNAc修饰检测方法,耗时相对O-GlcNAc特异性抗体缩短至5~7 h,丰富了蛋白质O-GlcNAc修饰的检测方法,为其后续研究奠定了基础。

转基因本氏烟草中CtDXR基因拷贝数及耐盐耐高温功能的初步分析

评估转基因本氏烟草中CtDXR基因的拷贝数,并初步分析其耐盐与耐高温能力。首先利用Southern Blot技术确定野生型本氏烟草中Actin基因的拷贝数,并以Actin基因为内参基因,以转CtDXR基因本氏烟草为材料,采用实时荧光定量PCR方法,检测转基因植株中CtDXR基因的拷贝数。最后,初步分析转基因植株的耐盐与耐高温能力。基于PCR方法,随机检测10株T1代转基因本氏烟草植株均能扩增出目的条带,表明它们均已成功转入目的基因CtDXR;Actin基因在本氏烟草基因组中为单拷贝基因;以Actin基因为内参基因,最终确定80%的转CtDXR基因植株为单拷贝或低拷贝株系;盐胁迫下,转CtDXR基因植株的株高(P<0.01)、侧根数(P<0.01)与鲜重(P<0.001)优于野生型植株,高温胁迫下,转CtDXR基因植株的株高(P<0.01)、叶片数(P<0.01)与鲜重优于野生型植株,表明转基因植株具有更强的耐盐和耐高温能力。利用研究建立的转基因本氏烟草外源基因拷贝数的检测方法,对转CtDXR基因植株完成外源基因拷贝数的鉴定,且初步鉴定了CtDXR基因具有耐盐与耐高温功能。

CREB1和CREB3在胃癌及癌前病变组织中的表达及其临床意义

目的探究环磷腺苷反应元件结合蛋白1(CREB1)和环磷腺苷反应元件结合蛋白3(CREB3)在胃癌及癌前病变组织中的表达及临床意义。方法收集慢性浅表性胃炎40例,慢性萎缩性胃炎伴肠化生40例,异型增生40例,胃癌50例,采用免疫组化法检测CREB1和CREB3在四种组织中的表达,并分析其与临床病理参数的关系。另收集同期新鲜组织慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎伴肠化生、胃癌共30例,应用蛋白印迹法(Western blot)检测CREB1和CREB3在不同胃组织中的表达。利用Kaplan-Meier plotter分析CREB1和CREB3的表达与胃癌患者总生存时间(OS)和无进展生存时间(FP)的相关性。利用STRING数据库分析CREB1和CREB3在信号通路中的位置以及与之相关的上下游基因。结果免疫组化显示:胃癌组、异型增生组、萎缩性胃炎伴肠化生组CREB1、CREB3阳性表达率明显高于慢性浅表性胃炎组(P<0.05);并且CREB1、CREB3在胃癌组的阳性表达率明显高于慢性萎缩性胃炎伴肠化生组(P<0.05),但与异型增生组无统计学差异(P>0.05)。临床病理参数分析得出两者表达水平与浸润深度、TNM分期、脉管侵犯、淋巴结转移相关(P<0.05);与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度无明显相关性(P>0.05)。Western blot结果显示:CREB1、CREB3蛋白表达在慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎伴肠化生、胃癌中依次增高,差异有统计学意义(P<0.01)。Kaplan-Meier plotter分析显示CREB1、CREB3高表达的胃癌患者OS和FP均缩短。结论CREB1、CREB3可能与胃癌的发生、发展与转移相关,且蛋白高表达可能与胃癌患者预后不良有关。

基于特征多肽抗原的阿胶基原鉴定

目的 以特征多肽为半抗原并制备多克隆抗体,鉴定阿胶原材料基原。方法 经文献调研及数据库比对筛选特征多肽,将多肽抗原与血蓝蛋白偶联并免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过ELISA、dot blot和Western blot分析与验证多克隆抗体的产生、效价及特异性。结果 筛选所得5个特征多肽序列均具有T细胞表位和B细胞表位,亲水性-1~0,二级结构大多为无规则卷曲。多肽抗原ECS1、ECS3~ECS5在二次加强免疫后,效价分别为1∶6 400、1∶400、1∶12 800和1∶800。制备所得的多克隆抗体之间不产生交叉反应,而且多克隆抗体Ab-ECS3与驴皮及其伪品蛋白的结合显现出较大差异。结论 以特征多肽为半抗原制备所得的多克隆抗体可通过Western blot对驴皮进行真伪鉴别,为胶类中药的基原鉴定提供了参考。

SIRT6在胃癌中的表达及临床意义

目的探讨沉默信息调节因子6(Sirtuin 6,SIRT6)在胃癌组织中的表达及临床意义。方法生物信息学分析SIRT6 mRNA在胃癌中的表达及其与生存、肿瘤突变负荷(TMB)及TIDE评分的关系;收集95例胃癌及癌旁组织标本,免疫组织化学方法检测SIRT6的表达水平,分析其与临床病理特征的关系;Western blot法检测10例新鲜胃癌及癌旁组织中SIRT6的表达情况。结果生物信息学分析显示,SIRT6 mRNA在胃癌中表达高于正常胃组织(P<0.05),Kaplan-Meier生存曲线显示SIRT6高表达组生存时间较短,突变相关分析及TIDE评分显示SIRT6高表达组具有更高的TMB及TIDE评分(P<0.05),且SIRT6 mRNA表达水平与TMB及TIDE评分呈显著正相关(P<0.05)。免疫组织化学结果显示SIRT6在胃癌组织中表达率为85.2%(81/95);SIRT6在胃癌中高表达与高Ki-67增殖指数相关,差异具有统计学意义(P<0.05),SIRT6表达在不同年龄、性别、肿瘤直径及P53等组间差异均无统计学意义(P>0.05);Western blot显示胃癌组织中SIRT6的表达水平高于癌旁组织(9/10),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论SIRT6在胃癌组织中高表达,可能通过影响基因组稳定性及胃癌细胞增殖能力参与胃癌的发生发展。

髓系特异性Spi1基因敲除小鼠的构建和基因鉴定

目的构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。方法根据CRISPR/Cas9技术原理和Cre/LoxP系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2两侧各放置同向Loxp元件;将Cas9蛋白、sgRNA和Donor载体混合显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宫中,19~20 d后获得F0代。将阳性F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到稳定的F1代Spi1^(flox/+)小鼠。F1代Spi1^(flox/+)小鼠雌雄自交得到Spi1^(flox/flox)小鼠。Spi1^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠交配得到Spi1^(flox/+)/Lyz2-Cre^(+)小鼠,再将其与Spi1^(flox/flox)交配,得到的Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(+)小鼠为髓系特异性Spi1基因敲除(KO)小鼠;Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(-)小鼠作为野生型(WT)小鼠。提取WT和KO小鼠DNA,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型;Western blot检测WT和KO小鼠免疫细胞中脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1/富含嘌呤盒1(PU.1)表达。结果PCR鉴定结果显示,采用flox引物鉴定时仅扩增出220 bp条带的小鼠,即基因型为Spi1^(flox/flox)纯合子,采用Lyz2-Cre引物鉴定时扩增出700 bp的小鼠,基因型为Lyz2-Cre^(+);Western blot结果显示,与WT组比较,KO组小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(PM)中的PU.1不表达(P<0.01);T细胞中KO小鼠PU.1表达水平与WT小鼠差异无统计学意义;PCR和Western blot结果均表明髓系特异性Spi1 KO小鼠构建成功。结论成功构建和鉴定髓系特异性Spi1 KO小鼠,为进一步揭示PU.1在免疫调节中的潜在机制研究提供动物模型基础。

SiewertⅡ型食管胃结合部腺癌中TRIB3表达及预后分析

目的探讨假激酶Tribbles同源物3(Tribbles homology 3,TRIB3)在SiewertⅡ型食管胃结合部腺癌(adenocarcinoma of esophagogastric junction,AEG)中的表达及其临床预后价值。方法采用Western blot法及免疫组化法对R0切除的SiewertⅡ型AEG及其对应癌旁组织中TRIB3的表达进行检测,并分析其与患者临床参数、生存及预后的关系。结果Western blot法检测结果显示,TRIB3在SiewertⅡ型AEG组织中的表达量显著低于癌旁组织(P<0.05)。免疫组化检测结果显示,癌组织中TRIB3的阳性表达率显著低于癌旁组织(P<0.01)。TRIB3的表达与肿瘤分化程度、临床TNM分期及淋巴结转移均显著相关(P<0.05),与患者的年龄、性别及病理形态均无关(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,TRIB3表达阳性的患者长期生存明显优于阴性的患者(P<0.01)。单因素(HR=0.290,95%CI:0.110~0.761,P=0.012)和多因素(HR=0.179,95%CI:0.051~0.630,P=0.007)COX回归分析结果显示,TRIB3可作为SiewertⅡ型AEG患者的独立预后因子(P<0.05)。结论TRIB3可能参与了SiewertⅡ型AEG的发生、发展过程,有望成为AEG早期诊断及治疗的新靶点,并可作为患者预后判断的重要指标。

复方中草药对运输后肉牛应激蛋白mRNA和蛋白表达水平的影响

文章旨在研究复方中草药对运输后肉牛应激蛋白mRNA和蛋白表达水平的影响,试验将40头健康、体重相近的荷斯坦育肥牛随机分成4组,每组10个重复,分别为对照组(1组)、0.5%(2组)、1.0%(3组)、1.5%(4组)复方中草药添加组,饲喂14 d后模拟运输应激。采用ELISA测定运输前、后荷斯坦育肥牛血清中HSP 70含量,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blotting分别测定运输后组织中HSP 70、HSP 90及HSP 27的mRNA和蛋白质水平的表达量。结果显示,运输后的各组荷斯坦育肥牛血清中HSP 70含量均高于运输前的(P<0.05),与对照组相比,试验3、4组试验运输前和运输后荷斯坦育肥牛血清中HSP 70含量显著降低(P<0.05),试验3、4组运输后的肉牛肌肉组织HSP 27、HSP 70及HSP 90的mRNA的表达量显著降低(P<0.05);试验3、4组运输后的肉牛肌肉组织HSP 70和HSP 90蛋白表达量显著降低(P<0.05)。说明运输可以提高肉牛血清和肌肉组织中应激蛋白含量,添加不同水平的复方中草药可以降低运输后肉牛血清及肌肉组织中应激蛋白的水平,以添加量为1.0%较适宜。

MCOLN1在腹主动脉瘤中的表达及对预后的影响

目的:探讨黏质蛋白1(mucolipin 1,MCOLN1)在腹主动脉瘤组织和非病变组织中的表达情况及对患者预后的临床意义。方法:选取2018年2月至2021年6月齐齐哈尔市第一医院收治的腹主动脉瘤患者80例,以腹主动脉瘤组织和临近的非病变组织标本作为研究对象,分为实验组腹主动脉瘤组织40例和对照组非病变组织40例。采用免疫组化实验法、Western blot实验法、RT-PCR实验法共同检测腹主动脉瘤患者中的MCOLN1因子的表达情况。结果:免疫组化实验结果中实验组MCOLN1的阳性率为82.5%(33/40),对照组MCOLN1的阳性率为22.5%(9/40)。两组数值相比,差异有统计学意义(χ^(2)=3.94,P<0.05)。Western blot实验结果中实验组MCOLN1蛋白表达含量为(5.47±1.22),对照组MCOLN1蛋白表达含量为(2.46±1.03),两组数据比较,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR实验结果中实验组检测MCOLN1 RNA表达为(3.67±1.06),对照组检测MCOLN1 RNA表达为(0.87±0.35),两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:以腹主动脉瘤生物学标记为腹主动脉瘤的发病机制提供新的理论依据和深层资料,同时可为腹主动脉瘤的早期诊断提供诊断依据和治疗靶点,能够对腹主动脉瘤疾病提高早期的筛查检出率,提升腹主动脉瘤的诊疗效果。

小麦TaTLP8的抗体制备及其蛋白水平表达分析

为探究TaTLP8类甜蛋白在小麦抵御叶锈菌侵染过程中的功能,以小麦近等基因系TcLr26及其轮回亲本Thatcher(Tc)为材料,分别与叶锈菌生理小种260组成不亲和与亲和组合。经生物信息学分析、原核表达、亲和层析、动物免疫,制备了TaTLP8的兔源多克隆抗体,并使用制备的抗体,对小麦与叶锈菌互作的不亲和与亲和组合中TaTLP8的表达情况进行了分析。结果表明,小麦TaTLP8与大麦HvTLP8同源性较高且N-端含有信号肽。以无信号肽区段的TaTLP8基因(TaTLP8-nosp)构建重组质粒pET28a-TaTLP8-nosp,并以0.100 mmol/L的最适浓度IPTG对该蛋白在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。以纯化后的TaTLP8-nosp重组蛋白免疫新西兰兔制备了抗体。Western Blotting检测发现,该抗体可与小麦中TaTLP8蛋白特异性结合。使用制备的抗体检测了小麦-叶锈菌不同亲和性组合中TaTLP8的表达水平,发现TaTLP8在不亲和组合中自接种叶锈菌8 h后启动表达,其表达量逐渐升高;在亲和组合中,直至叶锈菌接种后48 h才检测到TaTLP8的蛋白信号,并且其表达水平逐渐下降。总体而言,TaTLP8在不亲和组合中的表达水平高于亲和组合,说明TaTLP8在小麦抵御叶锈菌侵染的过程中可能发挥正调控作用。

边缘革蜱aqp基因的生物信息学分析及克隆与表达

蜱类水通道蛋白(AQP)是负责胞内外水分子运输的蛋白质,属于内在蛋白超家族成员。该蛋白是一种潜在的抗蜱疫苗候选抗原。为探究边缘革蜱(Dm)AQP(Dm AQP)的生物学特性及其是否具有抗原性,本研究利用PCR扩增Dm两条不同的Dmaqp基因,分别得到582 bp的Dmaqp1基因和1094 bp的Dmaqp2基因,并将其翻译成相应的蛋白,经各种生物信息学软件分析后显示,Dm AQP1和Dm AQP2蛋白理论等电点分别为4.76和8.65,Dm AQP1有4个跨膜区及1个天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)结构,Dm AQP2有4个跨膜区以及2个NPA结构;Dm AQP1和Dm AQP2蛋白分别有5个和9个B细胞抗原表位,11个和25个磷酸化位点,两种蛋白均为疏水性蛋白;Dm AQP1和Dm AQP2蛋白二级结构均主要由α-螺旋以及无规则卷曲组成,分别占34.02%、39.69%和32.93%、39.52%。基于Dmaqp1和Dmaqp2基因,从其编码区选择抗原决定簇密集且跨膜区域少的片段进行截短基因的PCR扩增,构建原核表达质粒p ET-32a-jd Dmaqp1和p ET-28a-jd Dmaqp2并转化至大肠杆菌BL21中,重组菌经IPTG诱导获得大小约为28 ku和14 ku的重组蛋白rjd Dm AQP1和rjd Dm AQP2;将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备小鼠多克隆抗体,western blot鉴定结果显示,两种蛋白分别出现了28 ku和14 ku的特异性条带,表明rjd Dm AQP1和rjd Dm AQP2均具有较好的反应原性。本研究首次经原核系统表达了Dm AQP,为进一步研究其生物学特性以及开展后续模式动物免疫抗蜱实验奠定基础。

边缘革蜱aqp 3截短基因的表达、生物信息学分析与多克隆抗体制备

【目的】挖掘和检测边缘革蜱(Dermacentor marginatus)水通道蛋白-3(DmAQP3)的免疫原性,为后续研发免疫抗蜱试验提供材料。【方法】利用PCR技术扩增Dmaqp 3基因,构建Dmaqp 3基因氨基酸序列系统发育树。对DmAQP3蛋白进行生物信息学分析,截选抗原性最佳区域构建截短重组质粒pET-32a-jdDmaqp3,表达DmAQP3重组蛋白(rDmAQP3),Western blotting检测重组蛋白的反应原性。将纯化的重组蛋白rDmAQP3免疫昆明小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测多克隆抗体效价。【结果】Dmaqp 3基因PCR扩增片段大小为879 bp,与森林革蜱aqp 3基因(XM_049662329.1)相似性为98.37%,DmAQP3蛋白氨基酸序列与森林革蜱(AQP-9亚型X2)及安氏革蜱(AQP-9样亚型X2)亲缘关系最近。DmAQP3蛋白理论等电点为8.65,是一种稳定蛋白;具有6个跨膜区及2个天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala,NPA)结构;有7个B细胞抗原表位,18个磷酸化位点,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋、β-转角、无规则卷曲及延伸链组成,占比分别为31.27%、3.58%、40.07%和25.08%;三级结构预测显示该蛋白由4个亚基组成。成功构建截短重组质粒pET-32a-jdDmaqp3并获得重组蛋白rDmAQP3。Western blotting结果显示,重组蛋白rDmAQP3与阳性血清反应出现大小为27 ku的目的条带,表明该蛋白具有良好的反应原性。间接ELISA结果显示,制备的重组蛋白rDmAQP3多克隆抗体效价高达1∶409600,表明该蛋白具有良好的免疫原性。【结论】本试验克隆了Dmaqp 3基因,构建了DmAQP3蛋白原核表达载体,诱导表达出重组蛋白rDmAQP3,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,为进一步研究其生物学特性及建立模式动物免疫抗蜱试验提供了条件。

子宫平滑肌瘤中TRIP6蛋白及mRNA的表达

目的探讨甲状腺激素受体相互作用蛋白6(thyroid receptor-interacting protein 6,TRIP6)在子宫平滑肌瘤中的表达及临床靶向药物治疗中的意义。方法采用Western blot法检测子宫平滑肌瘤和瘤旁正常子宫平滑肌组织中TRIP6蛋白表达,应用RT-PCR检测子宫平滑肌瘤和瘤旁正常子宫平滑肌组织中TRIP6 mRNA表达。结果11例子宫平滑肌瘤组织中,有8例(8/11,72.72%)TRIP6蛋白表达低于正常子宫平滑肌组织(P<0.05);有7例(7/11,63.64%)TRIP6 mRNA表达显著低于正常子宫平滑肌组织(P<0.05);其中,有7例(7/11,63.64%)TRIP6蛋白与mRNA表达水平一致降低。结论TRIP6在子宫平滑肌瘤中的表达降低,提示TRIP6表达降低可能与子宫平滑肌瘤的发生、发展相关。

鸡源EphrinA2基因的克隆表达及其单克隆抗体研制

研究旨在研制抗鸡EphrinA2蛋白的特异性单克隆抗体。试验用PCR和同源重组技术构建了鸡EphrinA2真核及原核表达载体,以纯化的EphrinA2原核表达产物免疫小鼠,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA方法筛选出阳性细胞克隆;用SDS-PAGE、间接免疫荧光试验和Western blot验证表达产物及单抗的特性。结果显示:原核表达的重组蛋白His-EphrinA2-RBD主要位于细菌包涵体中;获得2株能稳定分泌抗EphrinA2蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4H6和1G9;单克隆抗体4H6不仅能特异性识别真核表达载体pcDNA3.1-EphrinA2在DF-1细胞中表达的EphrinA2蛋白,而且能有效识别LMH和DF-1细胞中内源性的EphrinA2蛋白。结果表明,单克隆抗体4H6与鸡EphrinA2蛋白反应性和特异性均良好,能够应用于鸡EphrinA2相关基础研究。

桑黄酒的研制及其抗肿瘤活性研究

目的 探讨桑黄酒对BALB/c雌性小鼠的抗肿瘤作用。方法 以中药桑黄为主要原料,选用传统黄酒作为酒基,在单因素实验基础上,采用正交试验对桑黄酒制备工艺进行优化;利用H22肝癌细胞株建立荷瘤小鼠模型,将小鼠随机分为6组,即空白组、模型组、阳性组、桑黄酒低、中、高剂量组,连续14 d;酶联免疫吸附测定法(Elisa)检测血清中IL-6(白细胞介素-6)、IFN-γ(γ-干扰素)、TNF-α(肿瘤坏死因子)和VEGF(内皮血管生长因子)含量;苏木精-伊红染色法(HE)和免疫组化染色法观察肿瘤组织病理变化;同时采用蛋白质印迹法(Western-Blot)测定肿瘤组织相关蛋白表达。结果桑黄酒最佳制备工艺为桑黄与黄酒料液比3∶60、浸提时间21 d、浸提温度25℃。随着剂量递增抑瘤率逐渐升高,高剂量组抑瘤率可达38.4%,血清中IL-6(白细胞介素-6)、IFN-γ(γ-干扰素)、TNF-α(肿瘤坏死因子)含量显著升高,能显著促进肿瘤组织坏死和消融,出现伴有空隙或空泡片状棕黄色坏死区域。蛋白质印迹法(Western-Blot)结果表明,桑黄酒干预后可上调Bax(Bcl-2相关X蛋白)、Caspase-3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)、Caspase-8(半胱氨酸蛋白酶-8)、Caspase-9(半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9)蛋白表达,下调Bcl-2 (B淋巴细胞瘤-2)蛋白表达,与剂量成正比。结论桑黄酒作用机理主要通过线粒体途径和死亡受体途径,并与机体内IL-6(白细胞介素-6)、IFN-γ(γ-干扰素)、TNF-α(肿瘤坏死因子)等激活因子和Bax(Bcl-2相关X蛋白)、Bcl-2(B淋巴细胞瘤-2)、Caspase-3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)、Caspase-8(半胱氨酸蛋白酶-8)和Caspase-9(半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9)等蛋白表达有关,从而诱导其凋亡抑制肿瘤增殖。

非洲猪瘟病毒K205R蛋白的原核表达与单克隆抗体制备

为研发非洲猪瘟病毒的免疫检测试剂提供素材,制备非洲猪瘟病毒K205R蛋白的单克隆抗体。采用PCR方法扩增K205R基因,构建重组表达质粒pET-30a-K205R,将重组质粒pET-30a-K205R转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中并通过IPTG诱导表达ASFV K205R蛋白。将纯化出的蛋白乳化后免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选出来的单克隆细胞注射至小鼠腹腔中,待小鼠腹部膨大时收集腹水,通过ELISA方法鉴定腹水效价、Western blot和IFA鉴定单克隆抗体特异性及反应原性,并对单克隆抗体亚型进行鉴定。经SDS-PAGE鉴定,重组ASFV K205R蛋白成功表达。Western blot分析显示,His标签抗体能够特异性识别重组表达的ASFV K205R蛋白,表明其具有良好的特异性以及反应原性。通过细胞融合和细胞筛选得到1株能稳定分泌抗ASFV K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,将其命名为1C3G6。ELISA检测腹水中抗体效价为1∶100000。Western blot和IFA鉴定结果显示单克隆抗体1C3G6与K205R蛋白反应性良好。通过亚型鉴定,单克隆抗体1C3G6的重链为IgG2b类,轻链为Kappa型。经Western blot和IFA鉴定,筛选得到的1C3G6单克隆抗体可以特异性识别原核系统和真核系统表达的K205R蛋白,说明该抗体具有良好的特异性。

白消安对仔猪睾丸曲精小管内增殖分化相关蛋白表达与定位的影响

为了研究白消安对仔猪睾丸曲精小管内增殖分化相关蛋白PCNA、PLZF和GATA4表达与定位的影响,试验选取体外培养仔猪曲精小管为研究对象,分为对照组和试验组,其中试验组各添加5 mg/kg白消安,分别培养1、2、3 d,离心获取曲精小管,采用HE染色检测形态变化,采用免疫组化、qRT-PCR和Western blot法分别检测PCNA、PLZF和GATA4表达和定位的变化。HE染色结果显示,各试验组曲精小管内均含有支持细胞和生殖细胞;免疫组织化学结果显示,各试验组的PCNA蛋白定位于生殖细胞和支持细胞的细胞核,白消安作用可导致PCNA染色变深,表达量升高。各试验组GATA4蛋白定位于支持细胞的细胞核,且与对照组相比无明显差异;各试验组的PLZF蛋白定位于生殖细胞的细胞核,与对照组相比,白消安作用2 d时PLZF染色无显著差异,白消安作用1、3 d时PLZF染色变深,表达量升高。qRT-PCR和Western Blot结果显示,与对照组相比,试验组PCNA和GATA4 mRNA及其蛋白表达量均显著升高;白消安作用2 d的PLZF mRNA和蛋白表达量差异不显著,白消安作用1、3 d的PLZF mRN以及蛋白表达量均显著升高。综上所述,PCNA、PLZF和GATA4均表达于体外培养仔猪曲精小管,白消安作用可导致PCNA、PLZF和GATA4在曲精小管内表达水平改变,提示白消安通过影响增殖分化相关蛋白的表达导致猪睾丸精子发生受损。

HIF-1α纳米抗体的制备及其抑制黑素瘤生长的作用

缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)参与低氧微环境相关疾病的发生等过程,具有控制肿瘤生长和发展的功能。黑色素瘤是一种发生于人和动物恶性程度较高的肿瘤。为探明HIF-1α纳米抗体对黑色素瘤的影响,研究利用前期保存的羊驼源黑色素瘤细胞噬菌体文库筛选HIF-1α纳米抗体,经原核表达与纯化后,通过Western Blot和免疫组织化学验证HIF-1α纳米抗体与抗原的结合性;分别通过CCK-8法、划痕试验以及Western Blot法检测其对B16黑素瘤细胞的增殖和迁移能力及其相关分子表达的影响。结果表明,经表达和纯化获得的HIF-1α纳米抗体分子质量约为16 ku,没有跨膜结构,具有亲水性。通过Western Blot和免疫组织化学验证了其具有良好的抗原结合性。在增殖试验和划痕试验中,与对照组相比,HIF-1α纳米抗体抑制了B16细胞的增殖和迁移,下调了靶基因VEGF的表达,并使细胞增殖和迁移相关蛋白Ras、ERK、RAC和RAF的表达量下调。预测HIF-1α纳米抗体进入B16细胞内,与抗原结合,通过下游靶基因VEGF下调RAs、ERK、RAC、RAF的表达,从而对细胞增殖和迁移起抑制作用,可作为黑色素瘤治疗的新靶点。

猫白介素31蛋白的真核细胞表达及应用

该文通过哺乳动物细胞表达系统表达猫白介素31(fIL-31),并鉴定其与受体的结合。首先,构建重组质粒。其次,将重组质粒转染至293T细胞,经蛋白质印迹实验(Western blot)鉴定重组蛋白fIL-31-hFc的表达后,大量转染通过Protein A亲和层析和分子筛凝胶层析的方式纯化目的蛋白。最后,利用细胞流式的方法检测fIL-31-hFc与其受体猫抑瘤素M受体β(fOSMRβ)的结合情况。结果表明,fIL-31-hFc以可溶性的形式表达在细胞的上清中,经分子筛层析纯化后,可获得聚集形式均一的目的蛋白,该蛋白可与表达在细胞表面的fOSMRβ受体结合。