水稻细菌性条斑病抗性基因bls2 SSR分子标记开发

【目的】开发水稻细菌性条斑病(简称细条病)抗性基因bls2 SSR分子标记,为利用分子标记辅助选择培育水稻细条病抗性品种提供技术支撑。【方法】基于本课题组前期对细条病抗性基因bls2初定位结果,设计SL03与SL04分子标记区间的SSR引物,从中筛选出在亲本间具有多态性的引物,用于检测由普通野生稻DY19与籼稻9311为亲本构建的BC_(3)F_(2)群体中各单株的基因型,并结合细条病病斑长度测定结果,利用MapQTL 5.0精细定位bls2基因,鉴定出与之紧密连锁的SSR分子标记,并比较单标记或双标记的选择效果。【结果】通过田间细条病抗性鉴定发现,BC_(3)F_(2)群体抗、感分离符合理论比1∶3的孟德尔单基因遗传分离规律。利用筛选鉴定出的11个多态性分子标记对BC_(3)F_(2)群体共244个单株进行单株基因型检测,并结合单株抗性表型值,将细条病抗性基因bls2精细定位于2号染色体上RM13592和RM13599分子标记之间,物理距离240 kb;RM13592和RM13599分子标记在BC_(3)F_(2)群体上的分离比均符合1∶2∶1的单基因遗传分离规律。利用单标记和双标记均可有效选择BC_(3)F_(3)群体中的感病单株和抗病单株。RM13592和RM13599分子标记辅助选择符合率分别达92.62%和93.44%,使用双标记的选择符合率为93.44%。【结论】RM13592和RM13599与细条病抗性基因bls2紧密连锁,具有易于PCR扩增,易于识别,准确性高的特点,可作为水稻抗细条病育种上分子标记辅助选择的有效标记。

U2BL调控拟南芥下胚轴伸长的机制研究

下胚轴的伸长在植物早期存活和后期生长发育过程中均具有重要作用。本研究对拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)突变体进行了筛选,得到了具有短下胚轴表型的突变体u2bl,并对其下胚轴变短机制进行了初步研究。结果显示,突变体u2bl在不同光照条件下均表现出下胚轴较短的表型。细胞学实验表明,突变体u2bl下胚轴细胞长度的降低是其下胚轴较短的原因。赤霉素(GAs)是促进下胚轴伸长的主效应因子。但u2bl突变体对外源GA处理及内源GA合成抑制剂多效唑(PAC)处理均不敏感,表明U2BL基因可能影响GA的信号转导。亚细胞定位结果表明,U2BL在细胞核中富集。荧光定量Q-PCR分析结果显示,在u2bl突变体中,PRE1、SAUR16、YUC2、YUC8和PIF4等基因的表达均有显著下调,U2BL可能通过调控上述基因来间接调控下胚轴的伸长。本研究结果为进一步探讨U2BL在拟南芥生长发育及在其他物种中可能行使的功能提供了参考。

猪型布鲁氏菌rBLS重组蛋白的纯化与抗体制备

以猪型布鲁氏菌的BLS分子作为研究对象,通过重组蛋白质的纯化以及多克隆抗体的制备,研究了重组rBLS分子的免疫原性。结果表明:布鲁氏菌BLS分子具有较好的抗原性质,可以刺激家兔产生相应的抗体。

少侧蔓突变西瓜的株形与遗传基因bl的研究

一、目的与材料方法 西瓜〔Citrullus lanatus(Thunb)Matsum et Nakai)的少侧蔓突变是1969年前后,由新疆石河子142团技术员徐利元在‘苏联2号’西瓜的生产田中偶然发现的。由于该突变主蔓分枝少,减轻了大面积西瓜田间管理中的打杈作业强度,因此受到欢迎和重视。本试验利用黎盛显后来育成的‘无杈早’为材料,研究了西瓜少侧蔓突变的形态特征和遗传特性,从而为西瓜少侧蔓基因的确定和命名提出建议。

基因工程菌株BL21(DE3)(pECB-ST1)菌种的限定代次及保存条件试验

本文对基因工程菌株BL2 1(DE3) (pECB -ST1)菌种的限定代次及保存条件进行了详细研究。实验结果证实 ,基因工程菌株BL2 1(DE3) (pECB -ST1)基础种子体外传至 10代 ,其效力、培养特性均不发生变化 ,表明基因工程菌株BL2 1(DE3) (pECB -ST1)是一株良好的疫苗生产菌株。基因工程菌株BL2 1(DE3) (pECB -ST1)甘油菌种和冻干菌种分别在 2 0℃保存 2年和 3年 ,菌种的数量未明显减少 。

小麦水通道蛋白基因TaTIP1-1c-4BL的克隆与表达分析

为探究TaTIP1-1c-4BL基因在小麦响应缺水胁迫中的作用,采用PCR扩增的方法从小麦‘科农199’cDNA中获得TaTIP1-1c-4BL基因。生物信息学分析显示该基因编码区全长753 bp,共编码250个氨基酸。TaTIP1-1c-4BL蛋白具有6个跨膜域,为非分泌型、弱酸性、稳定型、疏水性蛋白。系统发育分析显示‘科农199’与来自粗山羊草和大麦的水通道蛋白亲缘关系较近。表达分析显示TaTIP1-1c-4BL基因在小麦根、茎、叶、籽粒及颖壳中均有表达,在茎中表达量最高。在PEG胁迫下,该基因的表达量下调,表明该基因在小麦应对干旱胁迫过程中具有负调控作用。在NaCl、ABA及H 2O 2胁迫下,表达量先下调后上调,推测该基因参与了某些抗逆信号的传导。

C57BL/6小鼠和C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠行为学实验研究

目的:通过水迷宫实验、自主活动实验、听源性惊厥实验和悬尾实验来研究C57BL/6小鼠和C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠的行为学差异。方法:通过胚胎复苏获得3只雌性杂合的C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠后与C57BL/6小鼠进行繁殖,最终得到纯合的雌性和雄性C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠各10只进行行为学实验。结果:在定位航行实验的第四天,KO(基因敲除型)组小鼠的潜伏期明显高于WT(野生型)组(P<0.01);空间搜索实验中,KO组小鼠的超越原平台的次数和平均速度均小于WT组小鼠(P<0.05);在工作记忆实验第四天,KO组小鼠的潜伏期高于WT组小鼠(P<0.05);听源性惊厥实验中,WT组小鼠的惊厥阈值低于KO组小鼠(P<0.01);自主活动实验中,KO组小鼠的自主活动次数高于WT组小鼠(P<0.01);在悬尾实验中,WT组小鼠的静止时间高于KO组小鼠,但不存在显著性差异。结论:在行为学实验中,KO组小鼠受到FMR1基因敲除影响,使KO组小鼠的运动能力和记忆能力明显低于WT组小鼠,更容易在声音的诱导下触发癫痫。

C57BL/6小鼠和C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠行为学及针刺长强穴治疗后的对比研究

目的:通过避暗实验、跳台实验和矿场实验来研究C57BL/6小鼠和C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠的行为学差异,并通过针刺长强穴治疗后进行行为学对比。方法:通过胚胎复苏得到3只雌性杂合的C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠后与C57BL/6小鼠进行繁殖,最终得到纯合的雌性和雄性C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠各10只进行行为学实验。结果:在避暗实验的第3天,WT(野生型)组小鼠的潜伏期大于KO(基因敲除型)组,WT组小鼠的电击次数低于KO组,且均存在显著性差异(P<0.05);在跳台实验中,WT组小鼠的潜伏期和错误次数均低于KO组小鼠(P<0.05);在旷场实验中,WT组小鼠的平均速度明显高于KO组小鼠(P<0.01),WT组小鼠在中央区域停留的时间高于KO组小鼠(P<0.05)。通过针刺长强穴治疗后,在避暗实验中,长强穴组小鼠的潜伏期高于非经非穴组、电击次数低于非经非穴组,且都存在显著性差异(P<0.05);跳台实验中的潜伏期和旷场实验中的平均速度以及中央区域停留时间,长强穴组均高于非经非穴组(P<0.05)。结论:在行为学实验中,KO组小鼠主要受到FMR1基因敲除影响,使KO组小鼠趋避性增加,对环境的认知能力及探索性下降,焦虑程度增强,其学习记忆能力和运动能力明显低于WT组小鼠,在针刺长强穴治疗后,通过避暗实验、跳台实验和旷场实验等行为学实验的对比实验表明:C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠是理想的脑瘫、脑卒中后遗症等疾病康复的实验动物模型,并且针刺治疗对其有显著的改善效果。

TLR配体对小鼠HPV11E7基因CTL表位肽的免疫调节作用

[目的]探讨Toll样受体（TLR）配体多聚肌苷酸-多聚胞苷酸（PIC）、非甲基化胞嘧啶嘌呤二核苷酸（CpG）对小鼠人乳头瘤状病毒（HPV）抗原肽-HPV11E7基因细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位肽的免疫调节作用.[方法]提取小鼠骨髓树突状细胞（BM-DC）（抗原递呈细胞）及脾细胞（效应细胞）,BM-DC经体外培养后与HPV11E7 CTL表位肽孵育,分为PIC组（添加PIC）、CpG组（添加CpG）、肽组（不添加试剂）及对照组（不做任何处理）.将肽和TLR配体处理后的BM-DC与脾细胞按1：17比例混合后低温保存备用.ELISA法检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及干扰素-γ（IFN-γ）.将培养7 d后的各组脾细胞培养液上清液（视为效应细胞）分别与表达HPV11E7基因的小鼠B16细胞（肿瘤细胞,视为靶细胞）按不同比例（200：1,100：1,50：1,25：1）均匀混合,乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测CTL杀伤活性.[结果]PIC组及CpG组TNF-α均明显高于肽组及对照组,差异具有统计学意义（P〈0.05）;CpG组IFN-γ明显高于其他三组,差异具有统计学意义（P〈0.05）,PIC组、肽组、对照组比较差异无显著性（P〉0.05）.在效/靶细胞比例25：1时各组CTL杀伤率无显著差异（P〉0.05）,当随着效/靶细胞比例增加PIC组及CpG组CTL杀伤活性均呈明显增高（P〈0.05）,但当比例增加到100：1以上时PIC组及CpG组增长幅度降低,呈现缓增趋势（P〉0.05）.[结论]TLR配体激动剂PIC及CpG均有明显CTL杀伤效果,可上调小鼠HPV11E7 CTL表位肽的免疫应答而使TNF-α分泌上调,而CpG还可上调IFN-γ分泌,提示PIC及CpG对小鼠HPV11E7 CTL表位肽有免疫调节作用.

利用嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌酶法合成5-氟尿苷的转化率影响因素的研究

研究酶法合成5-氟尿苷(5-FUR)的反应条件。利用嘧啶核苷磷酸化酶(Pyrimidine-nucleosidephos-phorylase,PyPNase)基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a+合成5-氟尿苷(5-FUR),考察不同反应条件对转化率的影响;尝试不同反应体系对转化率的影响。结果:(1)最佳转化条件:菌体:0.5WCG/L;UR:10mmol/L;5-FU:45mmol/L;PBS:40mmol/L;T:50℃;pH7.4;t:60min,转化率可达91.27%;(2)以Na2SO4溶液为溶剂,比以PBS溶液为溶剂的转化率略有提高。微生物酶法合成5-氟尿苷(5-FUR)的转化率较高,可考虑用于工业生产。

猪型布鲁氏菌rOmp31_(48-74)-BLS融合肽的诱导表达与纯化

目的:为了研究布鲁氏菌Omp31分子的抗原性质,以及布鲁氏菌BLS蛋白质的聚合功能,通过融合PCR技术,制备布鲁氏菌Omp3148-74与BLS的融合蛋白质,并且进行蛋白质的纯化。方法:以猪型布鲁氏菌Omp31基因和BLS基因作为研究对象,通过融合PCR技术构建重组表达载体,IPTG诱导融合蛋白质表达之后,利用His-tag亲和层析柱进行亲和纯化。结果:Omp3148-74-BLS融合DNA长度为531 bp,编码177个氨基酸;加上原核表达载体上的His-tag标签,融合蛋白质的实际大小为25.07 kD,实验结果证实表达载体构建正确,重组表达正确。结论:通过融合PCR技术构建的重组子pET-28-a-Omp3148-74-BLS,可以在大肠杆菌中成功表达;His-tag亲和层析技术可以纯化到Omp3148-74-BLS融合蛋白,而且蛋白质纯度较高。

布鲁氏菌rOmp31_(48-74)-BLS蛋白的多克隆抗体制备与检测

目的:研究布鲁氏菌Omp31分子的免疫原性。方法:利用IPTG诱导rOmp3148-74-BLS融合重组蛋白表达,经过His-tag镍柱进行亲和纯化之后,作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。结果:rOmp3148-74-BLS重组蛋白能够被大肠杆菌正确表达,而且,能够作为有效的抗原刺激家兔产生可以相互识别的多克隆抗体。结论:Omp31分子具有较好的免疫原性,可以引起较强的免疫反应。

布菌rBLS蛋白重组表达载体的构建与诱导表达

目的:构建猪型布鲁氏菌BLS分子原核表达载体,并进行诱导表达,为下一步关于BLS分子聚合功能的研究提供基础。方法:利用pET-28a(+)大肠杆菌原核表达系统,构建bls基因表达载体;利用IPTG诱导rBLS重组蛋白表达。结果:成功构建了布鲁氏菌bls基因的原核表达载体,重组蛋白分子量为21 kDa。结论:rBLS重组蛋白能够被大肠杆菌原核表达系统正确表达。

水稻金属硫蛋白基因(MT2bL)启动子的克隆与表达分析

金属硫蛋白(metallothionein,MT)富含半胱氨酸,而且能够结合多种金属离子,调控细胞内金属代谢的平衡。本研究根据水稻在减数分裂期、开花期和开花后5 d的基因芯片数据结果,从水稻品种黎榆B(O.sativa L.ssp.japonica C.V.Liyu B)基因组中克隆得到了一个植物MT-2类基因Metallothionein2b-Like(Os MT2b L)的启动子序列,序列全长2 063 bp。利用植物启动子区域顺式作用元件数据库(PLACE)分析表明该启动子序列含有5个CURE(copper-response element)元件(GTAC)以及多个其它顺式作用元件。构建了多个启动子融合表达载体(p Ca MV35S::GUS,p MT2b L::GUS,p Ubi1::GUS,p CYC::GUS和p ACT1::GUS),并通过根癌农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得了转基因植株。GUS组织染色结果分析表明,Os MT2b L基因启动子在水稻幼苗期的胚根、胚芽和胚芽鞘中具有高水平的GUS表达活性,特别是在胚根根尖和胚芽顶端的GUS表达活性较高;在减数分裂期的植株叶片、颖壳和开花10 d后的未成熟种子中GUS表达活性也较高;GUS蛋白荧光定量分析结果表明,Os MT2b L基因启动子在水稻叶片中驱动GUS基因表达的活性比Ca MV35S基因启动子高出3倍以上。

肾脏特异性高表达支架蛋白JLP转基因小鼠的构建

目的:构建肾脏特异性高表达支架蛋白JLP的转基因小鼠模型。方法:将遗传背景为C57BL/6N的loxp-stop-loxp-mSpag9阳性小鼠与KSP-CreERT2阳性小鼠进行饲养和繁殖,提取其子鼠脚趾DNA,采用PCR方法鉴定基因型,获取基因型为loxp-stop-loxp-mSpag9+/KSP-CreERT2+小鼠,待其长至4~6周龄时予以他莫昔芬诱导Cre重组酶表达。选择同窝C57BL/6N野生型小鼠作为对照,并通过Western Blot及组织免疫荧光检测小鼠各脏器中JLP的表达量,进一步验证肾脏特异性高表达mSpag9转基因小鼠的准确性及特异性。结果:Western Blot及组织免疫荧光结果显示:经他莫昔芬诱导的loxp-stop-loxp-mSpag9+/KSP-CreERT2+小鼠肾脏中JLP表达量显著高于同窝野生型小鼠,心脏、脾、肺、睾丸等组织中表达量无差异。结论:成功构建肾脏特异性高表达支架蛋白JLP的转基因小鼠,为进一步研究JLP在肾脏疾病中的作用及其机制提供了动物模型。