家蚕bmo-miR-3385-3p抑制丝素轻链基因BmFib-L的表达

为了探究家蚕中miRNA对丝素蛋白轻链基因(BmFib-L)表达的调控作用,以BmFib-L 3'UTR序列为靶序列,用RNAhybrid软件在线预测miRBase数据库中对靶基因具有调控作用家蚕miRNA,筛选到1个候选miRNA bmo-miR-3385-3p;采用荧光定量方法分析miR-3385-3p在幼虫5龄第1~7天后部丝腺和5龄第3天不同组织及BmFib-L在5龄第1~7天后部丝腺的表达水平;构建miR-3385-3p表达载体pcDNA3.0(ie1-egfp-pre-miR-3385-3p-SV40)和含萤火虫荧光素酶报告基因的BmFib-L 3'UTR重组质粒pGL3.0(A3-luc-BmFib-L-3'UTR-SV40),并人工合成miR-3385-3p的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor),以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,共转染BmN细胞,利用双荧光素酶检测系统验证miR-3385-3p对BmFib-L表达的调控作用。同时,对预测的BmFib-L 3'UTR上miR-3385-3p的靶位点进行了突变,在BmN细胞中进行了验证。进一步采用丝腺离体培养瞬时表达和5龄幼虫体腔注射转染物的方法,通过荧光定量分析后部丝腺靶基因表达水平的变化,验证miR-3385-3p在家蚕体内对BmFib-L表达的调控作用。结果表明,miR-3385-3p和BmFib-L在后部丝腺都有较高的表达水平,miR-3385-3p具备调控BmFib-L的可能性;在BmN细胞中miR-3385-3p对BmFib-L的表达具有显著抑制作用,预测的靶位点突变后miR-3385-3p对BmFib-L基因的表达没有抑制作用。在离体培养丝腺中和幼虫体内miR-3385-3p都显著下调BmFib-L基因的表达。由此证明,BmFib-L是miR-3385-3p的靶基因之一,miR-3385-3p可抑制BmFib-L的表达。

Bmo-miR-375-3p对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L表达的调控作用

【目的】探究家蚕Bombyx mori miRNAs对丝素蛋白轻链基因(fibroin light chain gene,Bm FibL)和P25蛋白基因Bm P25表达的调控作用。【方法】分别以Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR为靶序列,应用在线预测软件RNAhybrid从前期家蚕4和5龄幼虫后部丝腺(posterior silk gland)sRNA高通量测序获得的29个差异表达bmo-miRNAs中,筛选对Bm Fib-L和Bm P25具有调控作用的候选bmo-miRNAs;采用半定量RT-PCR方法在mRNA水平分析候选bmo-miRNAs及其靶基因Bm Fib-L和Bm P25在4和5龄幼虫期以及5龄第3天幼虫不同组织的表达水平;利用双荧光报告基因检测系统在家蚕细胞Bm N中验证候选bmo-miRNAs对Bm Fib-L和Bm P25表达的调控作用。【结果】筛选到一个在Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR上都有靶位点的bmo-miR-375-3p(曾称bmo-miR-375*)。在后部丝腺中bmo-miR-375-3p和其预测靶基因Bm Fib-L和Bm P25都有较高的表达水平,提示bmo-miR-375-3p具备调控Bm Fib-L和Bm P25表达的时空条件。miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm Fib-L 3'UTR的萤火虫荧光素酶(luciferase)报告基因(luc)表达载体共转染Bm N细胞,报告基因luc的表达水平显著下降;而在miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm P25 3'UTR的luc表达载体共转染Bm N细胞中报告基因luc的表达水平下降不显著。【结论】miR-375-3p显著下调Bm Fib-L基因的表达,而对Bm P25基因的表达无明显调控作用。

家蚕bmo-miR-0031-3p体内下调丝素轻链基因BmFib-L的表达

为了研究家蚕微RNA(microRNA, miRNA)对丝素轻链基因BmFib-L表达的调控作用,以BmFib-L mRNA的3′非翻译区(3′untranslated region, 3′UTR)为靶标,通过RNAhybrid软件分析,筛选出种子序列与BmFib-L 3′UTR完全互补的家蚕miRNA——bmo-miR-0031-3p(简称"miR-0031-3p")。分别构建miR-0031-3p表达载体pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-0031-3p-SV40]和BmFib-L 3′UTR融合萤光素酶报告基因重组表达质粒pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40],以海肾萤光素酶表达载体pRL-CMV为内参,共转染BmN细胞,通过检测双萤光素酶活性验证miR-0031-3p的功能;人工合成miR-0031-3p的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor),再进一步验证miR-0031-3p对BmFib-L的调控功能。结果显示,在BmN细胞中,miR-0031-3p显著抑制BmFib-L的表达。为了进一步验证miR-0031-3p在家蚕体内对BmFib-L表达的调控作用,在5龄第2天幼虫体腔内注射转染物,分别在体内过表达和抑制内源性miR-0031-3p,荧光定量分析靶基因表达水平。结果显示,miR-0031-3p在幼虫体内能够下调BmFib-L的表达。该研究结果有利于阐明家蚕miRNA功能和蚕丝蛋白表达调控的分子机制。