Bmo-miR-375-3p对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L表达的调控作用

【目的】探究家蚕Bombyx mori miRNAs对丝素蛋白轻链基因(fibroin light chain gene,Bm FibL)和P25蛋白基因Bm P25表达的调控作用。【方法】分别以Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR为靶序列,应用在线预测软件RNAhybrid从前期家蚕4和5龄幼虫后部丝腺(posterior silk gland)sRNA高通量测序获得的29个差异表达bmo-miRNAs中,筛选对Bm Fib-L和Bm P25具有调控作用的候选bmo-miRNAs;采用半定量RT-PCR方法在mRNA水平分析候选bmo-miRNAs及其靶基因Bm Fib-L和Bm P25在4和5龄幼虫期以及5龄第3天幼虫不同组织的表达水平;利用双荧光报告基因检测系统在家蚕细胞Bm N中验证候选bmo-miRNAs对Bm Fib-L和Bm P25表达的调控作用。【结果】筛选到一个在Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR上都有靶位点的bmo-miR-375-3p(曾称bmo-miR-375*)。在后部丝腺中bmo-miR-375-3p和其预测靶基因Bm Fib-L和Bm P25都有较高的表达水平,提示bmo-miR-375-3p具备调控Bm Fib-L和Bm P25表达的时空条件。miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm Fib-L 3'UTR的萤火虫荧光素酶(luciferase)报告基因(luc)表达载体共转染Bm N细胞,报告基因luc的表达水平显著下降;而在miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm P25 3'UTR的luc表达载体共转染Bm N细胞中报告基因luc的表达水平下降不显著。【结论】miR-375-3p显著下调Bm Fib-L基因的表达,而对Bm P25基因的表达无明显调控作用。

CCAT1靶向抑制miR-375-3p通过线粒体途径诱导的人口腔癌SAS细胞凋亡

目的:探究长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录因子1(CCAT1)靶向miR-375-3p通过线粒体途径诱导人口腔癌SAS细胞凋亡的作用。方法:人口腔癌SAS细胞随机分为空白组、CCAT1下调组、CCAT1上调组、CCAT1下调对照组、CCAT1上调对照组、miR-375-3p下调组、miR-375-3p上调组、miR-375-3p下调对照组和miR-375-3p上调对照组。转染48 h后,流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-375-3p表达、线粒体凋亡通路相关的基因半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3(caspase-3)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶9(caspase-9)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达;免疫印迹检测caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白表达;双荧光素酶报告实验分析CCAT1与miR-375-3p的靶向关系。结果:与空白组和CCAT1下调对照组比较,CCAT1下调组细胞凋亡率、miR-375-3p表达、caspase-3、caspase-9、Bax mRNA及蛋白表达升高,Bcl-2 mRNA及蛋白表达降低;与空白组和CCAT1上调对照组比,CCAT1上调组细胞凋亡率、miR-375-3p表达、caspase-3、caspase-9、Bax mRNA及蛋白表达降低,Bcl-2 mRNA及蛋白表达升高;与空白组和miR-375-3p下调对照组比较,miR-375-3p下调组细胞凋亡率、miR-375-3p表达、caspase-3、caspase-9、Bax mRNA及蛋白表达降低,Bcl-2 mRNA及蛋白表达升高;与空白组和miR-375-3p上调对照组比较,miR-375-3p上调组细胞凋亡率、miR-375-3p表达、caspase-3、caspase-9、Bax mRNA及蛋白表达升高,Bcl-2 mRNA及蛋白表达降低。双荧光素酶实验结果提示CCAT1可靶向调控miR-375-3p。结论:CCAT1可抑制人口腔癌SAS细胞凋亡,推测是通过靶向抑制miR-375-3p的表达,调控线粒体凋亡通路相关基因及蛋白的表达来实现的。

急性心肌梗死病人PCI术后血清miR-135b-3p、miR-375-3p相对表达水平及其与主要不良心血管事件发生的关系

目的:分析急性心肌梗死(AMI)病人行经皮冠状动脉介入(PCI)术后血清miR-135b-3p、miR-375-3p相对表达水平及其与主要不良心血管事件(MACE)发生的关系。方法:选取2018年1月—2021年1月我院收治的150例因患AMI进行PCI术的病人,同时选取同期100名健康体检者为对照组。采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测血清miR-135b-3p、miR-375-3p表达水平;采用Pearson法分析血清miR-135b-3p、miR-375-3p水平及其与临床资料的相关性;受试者工作特征(ROC)曲线评价血清miR-135b-3p、miR-375-3p对AMI病人PCI后发生MACE的预测价值。结果:相较于对照组,试验组血清miR-135b-3p、miR-375-3p水平显著升高(P<0.05)。与非MACE组相比,MACE组C反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、miR-135b-3p、miR-375-3p水平显著上升(P<0.05)。AMI病人血清miR-135b-3p与miR-375-3p、CRP、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平呈正相关(P<0.05);血清miR-375-3p与CRP、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平呈正相关(P<0.05)。ROC结果显示,血清miR-135b-3p、miR-375-3p水平及二者联合预测AMI病人PCI术后发生MACE的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.78,0.756,0.869,其中联合预测AUC显著高于二者单独预测(P<0.05)。结论:AMI病人血清miR-135b-3p、miR-375-3p水平升高,且PCI术后发生MACE病人miR-135b-3p、miR-375-3p水平高于非MACE病人,可能成为AMI病人PCI术后发生MACE的预测因子。

微RNA-375-5p对心力衰竭大鼠的保护作用及机制

目的探讨微RNA(miR)-375-5p对心力衰竭(HF)大鼠的保护作用及相关机制。方法将50只雄性Sprague Dawley大鼠随机分为假手术组、HF组、miR-NC组、miR-375-5p组、miR-375-5p+Compound C(CC)组,每组10只。HF组、miR-NC组、miR-375-5p组、miR-375-5p+CC组大鼠腹腔注射阿霉素溶液制备HF模型,假手术组大鼠腹腔注射等量的NaCl溶液。造模结束后次日,miR-375-5p组大鼠经尾静脉注射miR-375-5p mimics 100μL,miR-NC组大鼠经尾静脉注射miR-NC mimics 100μL,假手术组和HF组大鼠经尾静脉注射等量生理盐水,miR-375-5p+CC组大鼠经尾静脉注射miR-375-5p mimics 100μL和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂CC(0.2 mg·kg^(-1));各组大鼠均每日给药1次,连续给药4周。使用彩色多普勒超声仪检测各组大鼠心功能指标,反转录聚合酶链反应检测各组大鼠心肌组织中miR-375-5p表达,酶联免疫吸附试验检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平,苏木精-伊红染色观察各组大鼠心肌组织病理学变化,末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记法检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况,蛋白质印迹检测各组大鼠心肌组织中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、AMPK、沉默信息调节因子3(SIRT3)蛋白的相对表达量。结果与假手术组比较,HF组、miR-NC组和miR-375-5p组大鼠的左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、血清中SOD活性、GSH水平及心肌组织中p-AMPK/AMPK、miR-375-5p表达量和SIRT3蛋白相对表达量显著降低,左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、心肌细胞凋亡率及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平显著升高(P<0.05)。miR-NC组与HF组大鼠LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD、心肌细胞凋亡率、血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、GSH水平、SOD活性、心肌组织中p-AMPK/AMPK、miR-375-5p表达量及SIRT3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与HF组相比,miR-375-5p组大鼠LVEF、LVFS、血清中SOD活性、GSH水平、心肌组织中p-AMPK/AMPK及miR-375-5p表达量和SIRT3蛋白相对表达量显著升高,LVEDD、LVESD、心肌细胞凋亡率及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平显著降低(P<0.05)。与miR-375-5p组相比,miR-375-5p+CC组大鼠LVEF、LVFS、血清中SOD活性、GSH水平及心肌组织中p-AMPK/AMPK、miR-375-5p表达量和SIRT3蛋白相对表达量显著降低,LVEDD、LVESD、心肌细胞凋亡率及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平显著升高(P<0.05)。假手术组大鼠心肌细胞规律排列,细胞核明显且无炎症细胞浸润;HF组大鼠心肌细胞形态发生明显改变,排列紊乱,细胞间隙变大,染色变浅,且出现心肌纤维化,有大量的炎症细胞浸润,HF组和miR-NC组大鼠心肌组织病理学变化无明显差异;与HF组相比,miR-375-5p组大鼠心肌细胞排列明显有序,细胞坏死程度和范围明显减少;miR-375-5p+CC组与HF组大鼠心肌组织病理学变化相似。结论miR-375-5p能抑制HF大鼠心肌细胞凋亡,进而对HF大鼠发挥保护作用,其机制可能与激活AMPK/SIRT3信号通路有关。

miR-375-3p过表达的甲状腺乳头状癌细胞增殖和侵袭能力变化

目的探讨miR-375-3p过表达后甲状腺乳头状癌细胞增殖和侵袭能力以及PI3K/AKT/EMT信号通路相关蛋白的变化。方法取人甲状腺上皮细胞系Nthy-ori3-1和人甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1、BHP5-16、BHP2-7、K-1,采用RT-qPCR法检测细胞miR-375-3p表达。以四种甲状腺乳头状癌细胞中miR-375-3p表达最低的细胞为研究对象,将其分为转染组和阴性对照组,转染组通过转染miR-375-3p模拟物miR-375-3p-mimics上调细胞中miR-375-3p表达,阴性对照组转染阴性对照序列scramble。采用MTT法检测两组细胞增殖能力,Transwell实验观察细胞侵袭能力,Western blotting法检测细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-PI3K、p-AKT和上皮间质转化(EMT)相关蛋白E钙黏蛋白(E-cadherin)、N钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达。取甲状腺乳头状癌细胞,随机分为阴性对照组、miR-375-3p过表达组和miR-375-3p过表达+IGF-1组,miR-375-3p过表达组、阴性对照组分别转染miR-375-3p模拟物miR-375-3p mimics和阴性对照序列scramble,miR-375-3p过表达+IGF-1组转染miR-375-3p mimics并加入PI3K/AKT信号通路激动剂胰岛素样生长因子1(IGF-1)。观察三组细胞增殖和侵袭能力。结果人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1、BHP5-16、BHP2-7、K-1中miR-375-3p表达水平均低于人甲状腺上皮细胞Nthy-ori3-1(P均<0.05)。miR-375-3p过表达组转染24、48、72 h的OD值低于阴性对照组,侵袭细胞数少于阴性对照组(P<0.05或<0.01)。与阴性对照组比较,miR-375-3p过表达组p-PI3K和p-AKT表达水平降低,E-cadherin表达水平升高,N-cadherin、波形蛋白表达水平降低(P均<0.05)。加入IGF-1后,与miR-375-3p过表达组比,miR-375-3p过表达+IGF-1组细胞增殖OD值和细胞侵袭数均增加(P均<0.05)。结论miR-375-3p在甲状腺乳头状癌细胞系中下调表达,miR-375-3p过表达可抑制细胞增殖、侵袭过程,其机制可能与抑制PI3K/AKT/EMT信号通路有关。

miR-375-3p过表达调控Akt-eNOS信号通路促进心肌梗死大鼠心肌修复作用机制

目的探究miR-375-3p过表达调控丝氨酸-苏氨酸激酶(Akt)-内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路促进心肌梗死(MI)大鼠心肌修复作用的机制。方法将大鼠分为假手术(sham)组、MI组、阴性对照(NC)组、miR-375-3p组,各10只。比较各组miR-375-3p相对表达、心功能指标[左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、短轴缩短率(FS)、左室射血分数(LVEF)]、心肌损伤标志物[乳酸脱氢酶(LDH)、肌钙蛋白(cTnT)I、脑钠肽前体(Pro-BNP)]、心肌梗死面积、心肌组织病理学变化及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达。结果与sham组比较,MI组、NC组miR-375-3p表达显著降低;miR-375-3p组miR-375-3p表达显著高于sham组及MI组(P<0.05)。与sham组比较,MI组、NC组及miR-375-3p组LVEDD、LVESD及LDH、cTnTI、Pro-BNP显著升高,FS、LVEF及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达显著降低,MI面积显著增加(P<0.05)。与MI组比较,miR-375-3p组LVEDD、LVESD及LDH、cTnTI、Pro-BNP显著降低,MI面积显著减少,FS、LVEF及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论miR-375-3p过表达可激活Akt-eNOS信号通路促进MI大鼠心肌修复。

慢病毒介导miR-375-3p过表达对慢性心力衰竭大鼠心脏重塑的影响

目的探究慢病毒介导微RNA-375-3p(miR-375-3p)过表达对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心脏重塑的影响.方法腹腔注射5 mg/(kg·d)异丙肾上腺素构建CHF大鼠模型;超声检查仪检查收缩末期左心室内径(LVIDs)、舒张末期左心室内径(LVIDd)、缩短分数(FS)和射血分数(EF);HE染色观察心肌组织病理变化;Masson染色观察心肌组织胶原纤维沉积情况;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-375-3p、转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA和Smad3 mRNA相对表达量;蛋白质免疫印迹(West-ern blotting)法检测TGF-β1、Samd蛋白水平.结果miR-375-3p过表达可抑制CHF引起的LVIDd、LVIDs水平升高,EF、FS水平降低.miR-375-3p过表达可抑制CHF引起的TGF-β1、Samd3表达,从而保护心肌组织,抑制心肌胶原纤维沉积.结论miR-375-3p过表达对CHF有一定的保护作用,其机制可能与调控TGF-β1、Samd3表达有关.

家蚕bmo-miR-0031-3p体内下调丝素轻链基因BmFib-L的表达

为了研究家蚕微RNA(microRNA, miRNA)对丝素轻链基因BmFib-L表达的调控作用,以BmFib-L mRNA的3′非翻译区(3′untranslated region, 3′UTR)为靶标,通过RNAhybrid软件分析,筛选出种子序列与BmFib-L 3′UTR完全互补的家蚕miRNA——bmo-miR-0031-3p(简称"miR-0031-3p")。分别构建miR-0031-3p表达载体pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-0031-3p-SV40]和BmFib-L 3′UTR融合萤光素酶报告基因重组表达质粒pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40],以海肾萤光素酶表达载体pRL-CMV为内参,共转染BmN细胞,通过检测双萤光素酶活性验证miR-0031-3p的功能;人工合成miR-0031-3p的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor),再进一步验证miR-0031-3p对BmFib-L的调控功能。结果显示,在BmN细胞中,miR-0031-3p显著抑制BmFib-L的表达。为了进一步验证miR-0031-3p在家蚕体内对BmFib-L表达的调控作用,在5龄第2天幼虫体腔内注射转染物,分别在体内过表达和抑制内源性miR-0031-3p,荧光定量分析靶基因表达水平。结果显示,miR-0031-3p在幼虫体内能够下调BmFib-L的表达。该研究结果有利于阐明家蚕miRNA功能和蚕丝蛋白表达调控的分子机制。

家蚕bmo-miR-3385-3p抑制丝素轻链基因BmFib-L的表达

为了探究家蚕中miRNA对丝素蛋白轻链基因(BmFib-L)表达的调控作用,以BmFib-L 3'UTR序列为靶序列,用RNAhybrid软件在线预测miRBase数据库中对靶基因具有调控作用家蚕miRNA,筛选到1个候选miRNA bmo-miR-3385-3p;采用荧光定量方法分析miR-3385-3p在幼虫5龄第1~7天后部丝腺和5龄第3天不同组织及BmFib-L在5龄第1~7天后部丝腺的表达水平;构建miR-3385-3p表达载体pcDNA3.0(ie1-egfp-pre-miR-3385-3p-SV40)和含萤火虫荧光素酶报告基因的BmFib-L 3'UTR重组质粒pGL3.0(A3-luc-BmFib-L-3'UTR-SV40),并人工合成miR-3385-3p的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor),以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,共转染BmN细胞,利用双荧光素酶检测系统验证miR-3385-3p对BmFib-L表达的调控作用。同时,对预测的BmFib-L 3'UTR上miR-3385-3p的靶位点进行了突变,在BmN细胞中进行了验证。进一步采用丝腺离体培养瞬时表达和5龄幼虫体腔注射转染物的方法,通过荧光定量分析后部丝腺靶基因表达水平的变化,验证miR-3385-3p在家蚕体内对BmFib-L表达的调控作用。结果表明,miR-3385-3p和BmFib-L在后部丝腺都有较高的表达水平,miR-3385-3p具备调控BmFib-L的可能性;在BmN细胞中miR-3385-3p对BmFib-L的表达具有显著抑制作用,预测的靶位点突变后miR-3385-3p对BmFib-L基因的表达没有抑制作用。在离体培养丝腺中和幼虫体内miR-3385-3p都显著下调BmFib-L基因的表达。由此证明,BmFib-L是miR-3385-3p的靶基因之一,miR-3385-3p可抑制BmFib-L的表达。

妊娠期糖尿病miR-29、miR-372-3p、miR-375表达水平及其与胰岛素抵抗的相关性

目的:探讨妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)miR-29、miR-372-3p、miR-375表达水平及其与胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的相关性。方法:选取2019年5月至2020年5月南京市中西医结合医院诊治的220例GDM患者为研究组,并选取同期220例糖耐量正常的孕妇为对照组。检测并对比两组孕妇空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)及糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin, HbAlc)水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),比较两组孕妇外周血miR-29、miR-372-3p、miR-375的表达水平,并分析其与IR的相关性。结果:研究组FINS水平明显低于对照组,FBG、HbAlc水平及HOMA-IR均明显高于对照组(均P<0.05);研究组外周血miR-29的表达水平明显低于对照组,miR-372-3p、miR-375的表达水平均明显高于对照组(均P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示:研究组外周血miR-29的表达水平与HOMA-IR呈负相关(r=-0.379,P<0.05),外周血miR-372-3p、miR-375的表达水平与HOMA-IR呈正相关(均r=0.530、0.628,P<0.05)。结论:GDM患者外周血miR-29、miR-372-3p、miR-375的表达水平跟糖耐量正常的孕妇相比差异具有统计学意义,临床检测其表达水平对诊断GDM有较高的价值,且三者均与患者HOMA-IR有一定相关性,参与IR的发生、发展过程。

钩藤碱对甲基苯丙胺依赖SH-SY5Y细胞模型及miR-375-3p/Elavl4表达的影响

目的探讨钩藤碱对甲基苯丙胺依赖人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)模型及微小RNA-375-3p(miR-375-3p)/胚胎致死异常视觉-样4蛋白(Elavl4)表达的影响。方法用最大安全剂量诱导法建立甲基苯丙胺依赖细胞模型。将细胞分成正常组(完全培养液)、对照组(完全培养液+400μmol·L^(-1)钩藤碱孵育48 h)、模型组(完全培养液+100μmol·L^(-1)甲基苯丙胺孵育48 h)、实验组(完全培养液+400μmol·L^(-1)的钩藤碱孵育15 min后,再加入100μmol·L^(-1)甲基苯丙胺孵育48 h)。以酶联免疫吸附法检测细胞环腺苷酸(cAMP)、5-羟色胺(5-HT)水平;以实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞miR-375-3p表达情况;以蛋白质印迹法检测Elavl4蛋白表达情况。结果正常组、对照组、模型组和实验组cAMP表达水平分别为(6.33±0.93)、(6.57±1.12)、(10.89±1.03)和(7.81±1.32)pmol·mg^(-1);5-HT分别为(682.46±17.32)、(690.31±15.09)、(510.11±27.67)和(649.99±21.42)pg·mL^(-1);miR-375-3p表达水平分别为1.00±0.13、1.13±0.24、3.48±0.18和1.58±0.19;Elavl4表达水平分别为1.00±0.05、0.89±0.10、0.50±0.09和0.90±0.11。模型组上述指标与正常组比较,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05);实验组上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论本研究建立甲基苯丙胺依赖细胞模型,同时发现钩藤碱可能调控miR-375-3p/Elavl4表达拮抗甲基苯丙胺成瘾。

miR-221-3p调控血管生成抑制蛋白-1对黑色素瘤细胞侵袭和迁移的影响

目的 观察miR-221-3p、血管生成抑制蛋白-1(VASH-1)在黑色素瘤组织及黑色素瘤细胞系A375中的表达,探讨miR-221-3p、VASH-1在黑色素瘤细胞侵袭、迁移中的作用。方法 2019年1月—2021年9月新疆医科大学第一附属医院行手术治疗黑色素瘤患者21例,取手术切除的癌组织及癌旁组织。取对数生长期人黑色素瘤A375细胞及正常人表皮黑色素MC细胞。采用实时荧光定量PCR法检测癌组织、癌旁组织及A375、MC细胞miR-221-3p、VASH-1 mRNA相对表达量。取对数生长期A375细胞分为阴性对照组(转染siRNA-NC)、转染组(转染miR-221-3p siRNA),采用CCK-8法检测转染后培养12、24、48、72 h时细胞增殖率;采用Transwell小室实验检测转染24 h时迁移细胞数和侵袭细胞数;采用流式细胞术检测转染48 h时细胞周期;采用Western blot法检测转染48 h时VASH-1、GRB2、ERK1+2、VEGF-D、VEGF-α蛋白相对表达量。采用荧光素酶报告基因实验验证miR-221-3p与VASH-1的靶向关系。结果 (1)癌组织miR-221-3p、VASH-1 mRNA(2.469±0.161、3.909±1.124)相对表达量均高于癌旁组织(1.399±0.169、2.950±1.117)(t=21.024,P<0.001;t=2.776,P=0.008)。A375细胞miR-221-3p、VASH-1 mRNA(1.514±0.088、2.306±0.404)相对表达量均高于MC细胞(0.804±0.032、0.559±0.130)(t=13.188,P<0.001;t=7.131,P=0.002)。(2)2组转染后培养12、24、48、72 h时细胞增殖率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)转染24 h,转染组迁移细胞数[(319.515±15.325)个]和侵袭细胞数[(19.995±11.346)个]均少于阴性对照组[(494.155±13.126)、(114.005±11.266)个](t=14.991,P<0.001;t=10.184,P<0.001)。(4)转染48 h,转染组G_(1)期、S期、G_(2)期细胞比率与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(5)转染48 h,转染组VASH-1(0.426±0.029)、GRB2(0.519±0.020)、ERK1+2(0.755±0.061)、VEGF-D(0.544±0.028)、VEGF-α(0.315±0.012)蛋白相对表达量均低于阴性对照组(0.982±0.006、1.056±0.042、0.998±0.035、1.008±0.013、0.946±0.018)(P<0.05)。(6)miR-221-3p siRNA+VASH-1 WT组荧光素酶活性(0.507±0.006)低于miR-NC+VASH-1 WT组(1.062±0.040)(t=23.990,P<0.001),miR-221-3p siRNA+VASH-1 MUT组荧光素酶活性(1.082±0.048)与miR-NC+VASH-1 MUT组(1.019±0.019)比较差异无统计学意义(t=2.140,P=0.099)。miR-221-3p靶向VASH-1。结论 黑色素瘤miR-221-3p和VASH-1表达升高,下调miR-221-3p可沉默VASH-1及VEGF信号通路GRB2、VEGF-D、VEGF-α、ERK1+2蛋白表达,抑制黑色素瘤A375细胞的侵袭和迁移能力。

血清外泌体微小RNA-375-3p在吗啡依赖大鼠中的作用

目的探讨血清外泌体微小RNA(miR)-375-3p在吗啡诱导大鼠成瘾中的可能作用机制。方法通过剂量递增法诱导吗啡依赖大鼠戒断模型。将20只大鼠随机分为正常组和模型组,模型组连续6 d皮下注射吗啡,剂量依次递增为5、10、20、40、60、80 mg·kg^(-1),正常组仅注射0.9%NaCl。用实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)检测血清外泌体miR-375-3p表达水平。通过Target Scan、miRDB和DIANA Tools预测miR-375-3p靶基因。用DAVID数据库对其靶基因进行基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析。通过STRING软件对其靶基因编码蛋白进行互作分析。通过Cytoscape软件构建miR-375-3p-靶基因-KEGG网络。结果正常组和模型组第1次戒断评分值分别为2.38±1.21和25.11±3.46,第2次分别为2.51±1.09和17.32±2.67;正常组和模型组纳洛酮第1次催促后体质量分别为(213.95±10.90)和(193.43±15.22)g,第2次分别为(217.09±14.49)和(181.23±14.76)g。模型组与正常组比较,2次戒断评分值及体质量差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。正常组和模型组血清外泌体miR-375-3p相对表达水平分别为5.70±2.33和13.56±5.18。对miR-375-3p的306个潜在靶基因集合分析发现,其分子功能主要富集于神经元的产生、中枢神经系统发育等生物学过程(P<0.05),涉及谷氨酸能突触及多巴胺能突触等多条信号转导通路(P<0.05)。miR-375-3p靶基因编码蛋白之间存在复杂的相互作用,靶基因L型电压依赖钙离子通道α1C(CACNA1C)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白γ11(GNG11)、谷氨酸受体红藻氨酸离子5(GRIK5)、盘状大同源物3(DLG3)等编码蛋白在互作网络中具有核心地位。结论miR-375-3p可能通过调控中枢神经系统发育等生物过程作用于谷氨酸能突触及多巴胺能突触等信号通路进而调节下游靶蛋白参与吗啡成瘾的发生过程。

过表达miR-330-3p通过BMI1对黑色素瘤A375细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

目的探讨过表达miR-330-3p对黑色素瘤A375细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。方法采用miR-330-3p模拟物转染黑色素瘤A375细胞,设置空白组(未进行转染)、miR-330-3p正常对照组(转染无义序列)、miR-330-3p模拟物转染组(转染miR-330-3p模拟物),采用CCK-8法检测各组A375细胞的增殖,Transwell检测各组细胞侵袭能力,流式细胞仪检测各组细胞凋亡,Western blot检测各组细胞BMI1蛋白表达,应用Targetscan和双荧光素酶报告基因实验检测BMI1是否为miR-330-3p的靶基因。结果miR-330-3p过表达后,A375细胞的增殖和侵袭能力下降,细胞凋亡率上升,BMI1蛋白表达水平下降,生物信息学分析及双荧光素酶实验证实BMI1为miR-330-3p的靶基因。结论过表达miR-330-3p抑制A375细胞增殖和侵袭,促进其凋亡,与下调BMI1的表达相关。

miR-375-3p抑制DNA双链断裂的同源重组修复增强结直肠癌细胞放射敏感性的研究

目的探究miR-375-3p调控结直肠癌细胞放射敏感性的作用和机制。方法在结直肠癌细胞HCT116及HT29中过表达miR-375-3p,利用CCK-8法检测细胞增殖能力,利用克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,利用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡,利用流式细胞术检测细胞周期分布。过表达miR-375-3p后,检测γ-H2AX foci形成点数量、同源重组(HR)及非同源性末端连接(NHEJ)修复效率,分析miR-375-3p表达对DNA双链断裂(DSBs)以及其修复效率的影响;利用生物信息学预测miR-375-3p在HR修复通路中的下游靶基因,利用双荧光素酶报告基因法进一步验证miR-375-3p表达对靶基因重组蛋白A(RAD51)表达调控作用。最后,利用荧光定量PCR技术检测经^(60)Coγ射线2、6 Gy照射后HCT116细胞miR-375-3p的表达量;抑制miR-375-3p表达,经0、1、2、4、6 Gy不同剂量照射后,分析miR-375-3p表达变化对结直肠癌细胞HCT116放射敏感性的影响。结果过表达miR-375-3p显著抑制了结直肠癌细胞HCT116及HT29的增殖及克隆形成能力,诱发其细胞凋亡、G1期周期阻滞和DSBs损伤,下调了Rad51表达,显著降低了HR修复效率[miR-375-3p(3.55±0.30)%,miR-nc(1.97±0.15)%;t=10.055,P<0.05];双荧光素酶报告基因实验显示miR-375-3p能够靶向Rad513′UTR区域结合(t=5.013,P<0.05);电离辐射能诱导miR-375-3p表达,抑制其表达显著降低了结直肠癌细胞放射敏感性(t=6.460、5.619、10.150,P<0.05)。结论miR-375-3p能够靶向抑制Rad51表达,下调DSBs的HR修复效率,增强结直肠癌细胞的放射敏感性。