叶酸拮抗剂甲氨喋呤导致斑马鱼心脏发育异常及BMP2b HAS2表达下调

目的该研究利用叶酸拮抗剂甲氨喋呤（MTX）构建叶酸生物学活性受抑制的斑马鱼模型后，观察叶酸生物学活性受抑后对斑马鱼心脏发育的干扰作用以及对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响。方法用不同浓度的MTX处理不同发育时段的斑马鱼胚胎，于48hpf（hours post fertilization）观察胚胎心脏发育情况并计数各组心脏发育异常个体的百分比及心率，评定MTX对斑马鱼心脏发育的影响程度。用1．5×10^-3M的MTX处理6～10hpf发育时段的斑马鱼胚胎作为MTX处理组。于24hpf及48hpf在显微镜下观察MTX处理组斑马鱼胚胎心脏发育情况。借助胚胎整体原位杂交和Real-time PCR的方法检测BMP2b和HAS2在正常对照组及MTX处理组胚胎的表达水平。结果胚胎早期发育阶段6～12hpf是斑马鱼胚胎对MTX的敏感时期。显微镜下观察结果显示MTX处理组斑马鱼心脏发育延迟，并有心脏形态发育明显异常。胚胎整体原位杂交结果显示MTX处理组斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2在心脏的表达于36hpf及48hpf下调。Real-time PCR结果显示MTX处理组斑马鱼BMP2b的相对表达量在12，24，36及48hpf减少，HAS2的相对表达量在24，36及48hpf减少。结论叶酸生物学活性受抑对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。

建鲤骨形成蛋白质基因(BMP2B)片段的克隆及其表达分析

根据斑马鱼骨形成蛋白质2B基因(BMP2B)保守性特异序列设计引物,采用RT-PCR和3'-RACE技术克隆建鲤BMP2B基因,得到序列片段948 bp。经序列分析,该序列含有1个801 bp的开放阅读框(ORF),共编码266个氨基酸。利用Culstal W软件将该序列同其他25个物种进行氨基酸比对和同源性比较,结果表明,同源性在67.5%至90.6%之间。采用荧光定量PCR技术对鲤鱼脑、心脏、脾脏、肝脏、卵巢、鳃、肠和肌肉8个组织进行组织表达分析,结果显示,BMP2B基因在8个组织均有表达,在肌肉中的表达丰度最高,在卵巢、肝脏中其次,呈中度表达,再次是脾脏、鳃和肠,在心脏和脑中的表达量最低。

叶酸挽救乙醇致斑马鱼胚胎心脏和流出道发育异常

目的观察乙醇对斑马鱼胚胎心脏和流出道发育的干扰作用,并初步探讨叶酸挽救乙醇所致心脏和流出道发育异常的最佳时段和可能机制。方法在斑马鱼胚胎发育不同时段予以乙醇处理,观察胚胎的发育异常情况。将受精后7~12 h被予以乙醇组定义为乙醇处理组。在乙醇处理组胚胎的发育不同时段给予外源性叶酸进行叶酸挽救实验,观察各叶酸干预组胚胎的发育状况,探寻叶酸挽救的最佳时段。将受精后7~12 h给予叶酸组定义为叶酸挽救组。观察并统计乙醇处理组以及叶酸挽救组的胚胎发育异常百分比、存活百分比、心脏和流出道形态及其异常百分比、心率、心室收缩指数等指标来评估胚胎的发育状况。利用荧光显微造影的方法探查心脏流出道形态,采用胚胎整体原位杂交和Real-time PCR方法检测胚胎bmp2b、tbx1的表达情况。结果乙醇可干扰胚胎发育,乙醇处理组胚胎存在明显心脏和流出道形态异常以及心功能损害,在胚胎发育早期乙醇的干扰作用最明显。给予外源性叶酸能挽救乙醇导致的胚胎发育异常,在胚胎受精后7~12 h叶酸挽救作用最显著。乙醇处理组胚胎心脏和流出道的bmp2b、tbx1表达下降;予以叶酸干预后,乙醇处理组胚胎bmp2b和tbx1表达水平上调。结论叶酸能有效挽救乙醇导致的心脏和流出道发育异常,其机制可能是上调乙醇处理组胚胎bmp2b、tbx1的表达水平。

Tbx1基因功能下调影响斑马鱼Tbx20和Tbx2表达

目的采用吗啡啉修饰反义寡核苷酸显微注射方法下调斑马鱼Tbx1基因表达,研究斑马鱼Tbx1基因功能下调对其他两个T盒基因Tbx20和Tbx2表达的影响。方法采用吗啡啉修饰的反义寡核苷酸显微注射方法抑制斑马鱼Tbx1基因表达,分别将2.5、5、8、10 ng吗啡啉反义寡核苷酸在斑马鱼0-4细胞期注入胚胎,并构建Tbx20,骨形成蛋白2b(Bmp2b)和Tbx2反义RNA探针,进行整体原位杂交,观察Tbx1基因下调对Tbx20、Bmp2b及Tbx2表达的影响。结果Tbx1吗啡啉寡核苷酸显微注射组胚胎表现出鳃弓、耳囊、心血管系统和胸腺的发育异常。Tbx1基因下调导致Tbx20的表达出现改变,Tbx20在心脏的表达与对照组相比明显下调,神经元的表达范围明显缩小;Tbx1基因功能下调会导致Bmp2b在心脏和咽囊的表达减低,Bmp2b在后部咽囊的表达较前部咽囊减低得更为明显;Tbx1基因功能下调胚胎,Tbx2在鳃弓的表达模式发生改变,48 hpf,Tbx2在鳃弓的表达出现从后向前逐渐减低,鳃弓的表达范围较对照组明显缩小。结论Tbx1在发育过程中,会对其他T盒基因,如Tbx20和Tbx2具有激活或抑制的调控作用。Tbx1对Tbx20的作用可能是通过影响Bmp2b的途径,继发地影响Tbx20的表达。Tbx1基因功能下调,会改变Tbx2在鳃弓的表达模式。