猪精液冷冻保存程序的优化

研究共4个试验:①按入氮温度分为-5、-30、-60、-90、-120℃5个组;②按鲜精液预处理方式分为未预稀释和预稀释2个组;③按解冻温度设37、50、70℃3个组;④按稀释后精子密度分为1.25×108、2.50×108、5.00×108spz/mL 3个组。结果表明:①不同入氮温度下精子冻后活力差异不显著,但随着入氮温度的降低,精子冻后活力呈升高趋势;②预稀释不能显著提高平衡后精子活力,但可以显著或极显著提高精子稀释后活力、冻后活力、VAP、VSL及VCL等运动指标;③3种解冻温度在精子冻后活力、VAP、VSL、VCL等4个冻后运动指标上没有显著差异,但是,随着解冻温度的上升,冻后活力呈上升趋势;④3种稀释后精子密度在猪精子冻后活力、VAP、VSL上没有显著差异,但随着密度的上升,冻后精子活力及VAP呈下降趋势,而且最高密度组精子的VCL显著慢于其它两组。总之,5种入氮温度中,以-120℃组精子的冻后活力最高;预稀释对于新鲜猪精液的冷冻保存很有必要;3种解冻温度中,70℃组精子冻后活力最高;而高密度不利于猪精子的冷冻保存。

猪冷冻精子的细胞凋亡及凋亡途径初步研究

旨在研究低温冷冻解冻对精子细胞凋亡的影响,并探讨凋亡发生的可能相关途径。采用流式细胞仪检测解冻后精子内的ROS水平和TUNEL染色后的细胞凋亡情况,使用酶标仪检测精子内ATP含量,利用相对荧光定量PCR技术检测不同凋亡途径中相关基因的表达量变化。结果表明:冷冻后精子活力、顶体和质膜完整率显著下降(P<0.05);冷冻精子TUNEL染色后的凋亡率(80.4%)与新鲜组(9.7%)相比显著升高(P<0.05);冷冻组精子内ROS绿色荧光比率(58.2%)亦显著高于新鲜组(P<0.05);与新鲜组0.926μmol·L-1的ATP浓度相比,冷冻组精子的ATP浓度(0.247μmol·L-1)则显著下降(P<0.05);qRT-PCR检测结果显示,冷冻组中TNF-α、Fas、Caspase家族、P53和Bax基因相对表达量升高,其中Fas、P53、TNF-α、Caspase-8和Caspase-9等相对表达量显著升高(P<0.05);BCL-2、BIRC-5、MnSOD、CuZnSOD和SURVIVN基因相对表达量降低,其中BIRC-5、MnSOD、SURVIVN显著降低(P<0.05)。结果表明:低温冷冻解冻会使猪精子细胞发生严重的凋亡,死亡受体外源性凋亡途径和线粒体内源性凋亡途径均可能介导了冷冻后精子的凋亡。

褪黑素在猪精液保存中的抗氧化作用

为探讨褪黑素(MLT)在猪精液保存中的抗精子氧化损伤效应,采用分步筛选的方法,首先在15℃保存稀释精液中分别添加1×10-6mol/L(M1)、1×10-5mol/L(M2)、1×10-4mol/L(M3)、1×10-3mol/L(M4)和1×10-2mol/L(M5)MLT,以不添加MLT为对照组(M0),检验并选择MLT有效浓度用于15℃保存的离心精液,检验并选择MLT最佳浓度用于冷冻精液。结果表明:在保存6 d的稀释精液中,M1、M2和M3组精子活率(TMS)、质膜完整性(PMI)和顶体完整性(NAR)均高于M0,M2最高,M4、M5则显著低于M0(P<0.05);丙二醛(MDA)浓度均低于M0,并以M2为拐点先降后升;选择M1、M2和M3用于离心精液保存,6 d后TMS和NAR均高于对照组,且M2与对照差异显著(P<0.05),MDA浓度则逐渐降低且与对照差异显著(P<0.05);选择M2用于精液冷冻保存,解冻精液TMS、PMI、NAR和线粒体膜电位(Mt-MP)显著提高(P<0.05),MDA浓度显著降低(P<0.05)。可见,添加适宜浓度MLT能够抑制稀释、离心及冷冻保存猪精液中的精子氧化损伤,显著提高精液保存质量。

芝麻酚对猪精液冷冻保存效果的影响

为了探究芝麻酚对猪精液冷冻保存效果的影响,用手握法采集成年杜洛克公猪精液,预处理后添加不同浓度芝麻酚(0,0.05,0.10,0.15,0.20和0.25g/L)的冷冻稀释液进行稀释,冷冻-解冻后检测猪精子活率、质膜完整性(低渗肿胀试验)、线粒体活性、顶体完整性、DNA完整性以及超氧化歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性等。结果显示:当芝麻酚添加浓度为0.20g/L时,解冻后精子活率、线粒体活性、质膜完整率和顶体完整率为最高,相比较于对照组,分别提高了12.67%、19.07%、18.78%和14.09%(P<0.05);MDA含量最低为2.04nmol/mL(P<0.05);SOD和GSH-Px酶活最高为73.04U/mL和237.59U/I(P<0.05)。当芝麻酚添加浓度为0.25g/L时,DNA完整性最高为72.46%(P<0.05)。当芝麻酚添加浓度为0.15g/L时,CAT酶活最高为3.44U/mL(P<0.05)。结果表明:与对照组相比较,在猪精液冷冻稀释液中添加适当浓度的芝麻酚能显著提高解冻后猪精子活率、功能完整性和抗氧化能力(P<0.05),且当芝麻酚的浓度为0.2g/L时对猪精子冷冻保存效果最好。研究结果表明,芝麻酚作为一种天然抗氧化剂,对猪精子冷冻保存具有良好的效果。

含海藻糖稀释剂增补EDTA对猪精子冷冻能力的影响

探讨了猪精子冷冻保存液中添加不同浓度的海藻糖（trehalose）和EDTA（0．05mol／L trehalose、0．05mol／L trehalose＋2．0mmol／L EDTA、0．05mol／L trehalose＋5．0mmol／L EDTA、0．1mol／L trehalose、0．1mol／L tre—halose＋2．0mmol／L EDTA、0．1mol／L trehalose＋5．0mmol／L EDTA）对猪精子冷冻效果的影响。结果表明。精子冷冻解冻后，0．1mol／L trehalose＋2mmol／L EDTA混合处理组精子活力显著高于0．1mol／L trehalose处理组（P〈0．05），0．1mol／L trehalose和5．0mmol／L EDTA混合处理组的精子生存率最高。0．1mol／L trehalose和2～5mmol／L EDTA混合处理组精子顶体完整率显著高于trehalose处理组（P〈0．05）。0．05～0．1mol／L trehalose和5．0mmol／L EDTA混合处理组低渗膨胀精子率显著高于trehalose处理组（P〈0．05）。trehalose和EDTA混合处理组精子内活性氧（ROS）含量总体上高于trehalose处理组（P〈0．05）。这些结果显示稀释剂中trehalose和EnTA增补能改善精液特性，但不能抑制精子内ROS的发生。

不同双糖组合对猪精子冷冻保存效果的影响

为了评价不同的双糖(乳糖、蔗糖和海藻糖)添加于卵黄基础稀释液中对猪精子的冷冻保护作用,实验采用了7个冷冻保护液配方,其中第一个配方为前期实验筛选得到的乳糖卵黄稀释液(LEY),将蔗糖和海藻糖以不同的比例完全或部分替代第一个配方中的乳糖成分而获得另6个配方。精子冻后质量评价活力、顶体完整率、低渗肿胀率及畸形率等指标。结果表明,当稀释液中只添加乳糖时(LEY液,A组),猪精子的冻后活力最低;当用蔗糖或海藻糖部分替代或完全替代乳糖时,猪精子冻后各项指标都有所改善。当33.3%的乳糖和66.7%的蔗糖进行组合(F组)时,猪精子冻后活力达37.0%±2.6%,显著优于其他各组(P<0.05),其他各项指标也显著高于单一的乳糖组(A组)。研究结果表明,将不同双糖以不同比例组合添加于猪精液冷冻保护液后,以33.3%的乳糖和66.7%的蔗糖的组合(F组)对猪精液冷冻保护的效果最好。

不同添加剂及剂型对猪冷冻精液品质的影响

试验旨在研究咖啡因、维生素E、超氧化物歧化酶(SOD)及剂型对猪冷冻精液品质的影响。采用添加了不同浓度咖啡因、维生素E、超氧化物歧化酶(SOD)的冷冻稀释液和3种剂型的冻精管进行精液冷冻。3种添加剂对冻精解冻后的精液品质都有一定的促进作用,试验中其添加最适浓度分别为:咖啡因为0.2mg/mL,维生素E为0.4mg/mL,SOD为300IU/mL;0.25mL剂型的冻精解冻后精子品质最好。咖啡因、抗氧化剂及冻精管剂型对冷冻精液的效果有一定的影响。

利用流式细胞仪评价不同防冻液对猪冻融精子成活率及凋亡状况的影响

人工采取5头优质大白猪精液,利用BTS稀释液和添加氨基—钠—十二烷基硫酸脂(OEP)、十二烷基硫酸钠(SDS)及卵黄所组成的防冻液稀释后,冷冻程控仪制成细管冻精,采用荧光显微镜及流式细胞仪对冷冻复苏后精子质膜完整率和凋亡状况进行测定,目的在于比较不同检测方法评估猪冻融精子活率的差异性,探讨OEP、SDS对猪冻融精子质膜完整率和凋亡状况的影响。结果表明,Annexin-V/PI染色流式细胞术能准确测出猪冻融精子质膜完整率及处于凋亡状态的数量,同Annexin-V/PI染色流式细胞术相比,利用SYBR-14/PI染色荧光显微镜法往往高估冻融精子的死亡率。各处理组间冻融精子质膜完整率及凋亡数量存在一定差别,添加OEP防冻剂的实验组早期凋亡精子的比例显著低于对照组(P<0.05),而正常活性精子的比例(46.5%)显著高于对照组(37.2%)(P<0.05),结果提示:OEP对维持冻融精子质膜完整性、抑制冻融精子凋亡起到较好作用。

海藻糖、二甲乙酰胺对公猪精液冷冻保存效果的研究

采用5%二甲乙酰胺(DMA)(V/V)完全替代甘油,比较乳糖、海藻糖对精液冷冻保存效果的影响。结果表明,海藻糖显著提高了冷冻——解冻后精子成活力(49.32%±1.52%)与顶体完整性(47.33%±1.16%)(P<0.05)。然后利用海藻糖替代乳糖,评价不同浓度的DMA对公猪精液冷冻保存的影响。结果表明,当DMA添加量为4%时,解冻后精子活率、成活力、顶体完整率分别为(45.17±0.56)%、(50.33±0.67)%、(48.30±1.44)%,均显著高于3%DMA、6%DMA添加组(P<0.05),精子活率显著高于5%DMA添加组(P<0.05),但精子成活力、顶体完整性与其差异不显著(P>0.05)。因此,当利用海藻糖作为冷冻保存基础稀释液,DMA最适添加量为4%。

猪精子微胶囊的制备及其对精子质量的影响

为了探讨猪精子微胶囊制作参数,优化猪精子微胶囊制作工艺,提高微胶囊及微胶囊化保存的猪精液质量。将猪精液进行稀释变成1×10^8个/m L,利用海藻酸钠和钡离子反应制成猪精子微胶囊,检测海藻酸钠和钡离子不同反应时间对胶囊的参数及猪精子质量的影响,以确定最优的微胶囊反应时间的参数。结果表明：5、20、60 min反应时间组之间在胶囊强度分别为23.5、35.5、66.0 g/个,壁厚分别为557.5、1 009.0、1 156.5μm,重量分别为80.0、112.0、135.0 mg以及缓释率（24 h时分别为9.40×104、6.00×10^4、4.50×10^4）sperm/个胶囊,以上指标存在显著差异（P〈0.05）。其中5 min反应组的强度最差;而60 min反应组缓释率最低,不利于精子的释放。此外,20 min和5 min反应时间组在微胶囊化保存后猪精子的活力显著高于60 min反应组,而在精子畸形率上都明显低于60 min反应时间组（P〈0.05）。综上可见,钡离子-海藻酸钠微胶囊反应时间在20 min时达到最佳,微胶囊保存猪精子质量最好。

添加剂在猪精液冷冻保存中的应用

猪精液的冷冻保存显著影响猪精子的运动学参数,损伤精子质膜、顶体和DNA完整性,降低解冻后精子活率和受精能力。近年来,在以甘油和蛋黄作为冷冻保护剂的基础上,为了有效降低冷冻-解冻对精子的损伤,提高解冻精液的受精能力,研究人员将OEP、抗氧化剂(甲基黄嘌呤、丁羟基甲苯、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、褪黑素和维生素E等)、2-羟丙基β环糊精以及透明质酸等物质作为添加剂应用于猪精液的冷冻保存,结果表明这些物质在保护精子质膜和顶体完整性,提高解冻后精子活力、活率和受精能力等方面均有显著作用。

获能和冻融猪精子前顶体蛋白活化机制研究

利用SDS-PAGE和Western Blotting的方法,分析冻融和获能处理中猪精子前顶体蛋白的转化过程。结果表明,显示获能组精子荧光区域大于冻融组精子,而小于新鲜精子组;新鲜组精子出现大约45和35kDa分子量的条带,而冻融和获能组精子都同时出现大约45、35和28kDa分子量的条带。总之,冻融后顶体完整的精子和获能精子Proarosin都能正常活化成α-acrosin、β-acrosin和28kDa,这个途径可作为预测受精的指标。

猪精子α-L-岩藻糖苷酶活性定位及其在精-卵结合及受精中的作用

本试验旨在证明猪精子中α-L-岩藻糖苷酶的存在及其在受精中的作用。猪精子α-L-岩藻糖苷酶活性用分光光度计405nm波长测定,并在受精液中添加α-L-岩藻糖苷酶特异抑制因子(deoxyfuconojirimycin hydrochloride,DFM-H)或特异单糖(L-岩藻糖)来检测对该酶活性的影响。结果显示,猪精子含有明显的α-L-岩藻糖苷酶活性。当精子用10μmol/L钙离子载体A23187处理1h后,有70%精子发生顶体反应和72%的酶活性被释放。体外受精液中添加250μmol/LDFM-H或30mmol/L L-岩藻糖,可分别抑制66%或63%的精子α-L-岩藻糖苷酶活性,并相应抑制37%或36%的透明带表面精子结合数及56%或67%的精子侵入卵数。这些结果证明,猪精子α-L-岩藻糖苷酶主要分布于精子顶体中,特异地作用于透明带寡糖链中的α-L-岩藻糖残基,而参与精子穿入透明带的过程。

纳米硒对波尔山羊睾丸发育的影响

为了研究日粮中添加纳米硒对公羊睾丸发育的影响,试验选用体重、日龄接近的20只波尔山羊公羔羊随机分2组,1组日粮中添加0.3mg/kg的纳米硒(以硒计),另一组饲喂基础日粮,预试2周,试验期每月测量睾丸周径、长度和高度,每组阉割1只公羔,按照常规方法制作石蜡切片,观察睾丸组织结构。结果显示,3月龄时纳米硒组睾丸间质组织增生发育,4月龄时纳米硒组睾丸曲精细管中精原细胞开始发育分化;5月龄时曲精细管中可见大量的精子,而对照组间质组织以及曲精细管发育、精母细胞发育分化较纳米硒组缓慢。试验表明,日粮中添加一定浓度的纳米硒能够促进睾丸间质组织及曲精细管的发育,促进精母细胞的分化。

细胞凋亡相关Caspases在猪精子冷冻过程中的表达谱研究

[目的]探究不同冷冻保护剂冷冻猪精子后,精子中Caspases表达模式.[方法]采用普通PCR和荧光定量PCR技术检测Caspase-1～15在添加不同冷冻保护剂冷冻猪精子后的表达谱.[结果]①甘油和乙二醇可以抑制Caspase-2、-8、-13的表达,而DMSO只能抑制Caspase-2和Caspase-8的表达.②海藻糖和乳糖能有效地抑制Caspase-2、-8、-13、-15的表达,而蔗糖能有效地抑制Caspase-1、-6、-13和Caspase-15的表达.③超氧化物歧化酶和过氧化氢酶可以有效防止Caspase-2、-8和Caspase-13的表达,而谷胱甘肽仅可以有效地抑制Caspase-13的表达.④不添加抗冻剂冷冻对凋亡执行子Caspase-3和Caspase-7的表达没有影响.[结论]冷冻保存主要影响凋亡启动子在猪精子中的表达,添加甘油、蔗糖、乳糖能有效抑制猪精子冷冻解冻造成的凋亡.

熊果酸对猪精液冷冻保存效果的影响

猪精子冷冻是长久保存珍贵家猪品种遗传物质的有效手段,然而因其细胞膜结构组成的特殊性,猪精子经过冷冻后活力大不如前。熊果酸是一种天然的、具有抗氧化作用羧酸类化合物,在其他多个领域已被报道具有优异的抗氧化功能。为研究熊果酸对长白公猪冷冻精液的作用,该试验在猪精子冷冻稀释液中分别添加不同浓度梯度(0、1.0、1.4、1.6、1.8和2.0 mg/mL)的熊果酸,并检测冷冻-解冻后猪精子的活力及其他相关参数。结果表明,当添加1.6 mg/mL熊果酸提取液时,与对照组相比较,精子活力(50.27%±3.24%)显著增加(P<0.05);同时STR和VAP数值明显提高(分别为54.95%±3.35%和36.53±3.28μm/s)(P<0.05),VCL也最高(59.63±3.11μm/s)(P<0.05)。每个处理组之间VSL、LIN、ALH值无显著性差异(P<0.05)。结果表明,1.6 mg/mL熊果酸的添加可以显著提高猪冷冻精子的各项质量参数。

鸽蛋低密度脂蛋白对冷休克和冻融猪精子HSP70及凋亡相关基因表达的影响

旨在探究鸽蛋低密度脂蛋白(LDL)对冷休克和冻融猪精子HSP70及凋亡相关基因表达的影响。试验分为5组,分别是鲜精组、3%LDL(-80和-196℃)处理组、9%LDL(-80和-196℃)处理组。采用CASA系统分析不同处理组添加不同浓度鸽蛋LDL对冷休克及冻融前后猪精子生物学性状的影响;通过SDS-PAGE、Western blotting、PCR扩增检测分析HSP70蛋白及凋亡基因表达量的变化。结果表明:猪精子经过冻融处理后,热休克蛋白HSP70的表达量高于鲜精组,同时添加9%鸽蛋LDL并置于-196℃保存的冻融精子的热休克蛋白HSP70的表达量与鲜精组无显著差异(P>0.05);在抗凋亡基因Bcl-x1、Bcl-2l试验中,鲜精组的基因表达量均高于其他处理组,添加9%LDL(-196℃)处理组的基因表达量与鲜精组无显著差异(P>0.05);在促凋亡基因Bak试验中,鲜精组的基因表达量最低,且添加9%LDL(-196℃)处理组的Bak基因表达量与鲜精组无显著差异(P>0.05)。添加鸽蛋LDL可在一定程度上降低猪精子在冻融过程中造成的损伤,维持猪精子正常生物学性状,提高猪精子存活率。

猪精子冷冻损伤研究进展

综述了猪冻存精子顶体、质膜和线粒体的形态学变化及其对精子受精能力的影响,同时分析了冻融精子中所发生的蛋白质、DNA等生物大分子的变化及其可能对冻存精子质量及受精能力的影响,指出冷冻保存过程对精子蛋白质、DNA等生物大分子质和量的影响是精子冷冻损伤的实质,应用先进的蛋白组学进行猪精子冷冻损伤机理研究,有助于深刻揭示冷冻损伤的分子机理,为推动猪精液冷冻保存技术研究取得突破性进展提供理论依据。

海藻糖对猪精子冷冻真空干燥保存效果的影响

猪精子经冷冻干燥后,在光学显微镜和电子显微镜下观察其超微结构,并借助辅助生殖技术将其注入猪卵母细胞后,进一步观察受精卵的发育情况。结果表明:海藻糖组雄原核形成率(68.52%)、卵裂率(59.17%)和囊胚率(19.16%)优于EDTA组(64.59%、56.26%和15.62%)和对照组(35.36%、52.33%和8.60%)(P<0.05);海藻糖组的冷冻真空干燥猪精子分别在4℃下保存60、120、180d,雄原核形成率、卵裂率和囊胚率均无显著差异(P>0.05);海藻糖组的冷冻真空干燥猪精子复水化后孵育1h和2h,卵裂率、卵裂率和囊胚率均差异显著(P<0.05);海藻糖处理组与EDTA处理组中的冷冻真空干燥猪精子分别在4℃和-20℃下保存后各处理组间精子形态差异不显著(P>0.05);海藻糖组中B级冷冻真空干燥精子百分数显著多于EDTA处理组(P<0.05)。超微结构分析表明,冷冻真空干燥猪精子的损伤主要表现在顶体和颈部的肿胀与缺损、尾部断裂。

纳米化聚酰胺-胺型树枝状聚合物对猪精子介导基因转移效率的影响

为优化猪精子介导的基因转移(SMGT)技术,提高转基因效率,本试验利用纳米化聚酰胺-胺型树枝状聚合物(PAMAM-D)为载体介导猪精子转染外源DNA,经原位杂交检测其阳性率,体外受精(IVF)分析外源基因的表达。结果显示,0.5μg线状质粒DNA中加入PAMAM-D(质量比20∶1)阳性率最高(P<0.05);孵育时间为90、120min时,阳性率显著高于30、60min组(19.94%、18.57%与8.50%、13.87%;P<0.05);以此条件处理精子,阳性率显著高于无载体和脂质体处理组(23.93%与7.25%、13.25%;P<0.05)。各处理精子经IVF后,PAMAM-D组EGFP表达率显著高于其他2组(9.19%与4.81%、3.43%;P<0.05),各组绿色荧光胚胎经基因组PCR分析均能检测到EGFP基因。结果表明,PAMAM-D可有效介导猪精子转染外源DNA,并通过体外受精将外源基因导入胚胎中。