光固化水凝胶负载骨髓间充质干细胞修复大鼠颅骨缺损

目的探讨新型甲基丙烯酸酐化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)/骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)复合水凝胶应用于大鼠颅骨缺损区的成骨性能,为骨再生生物材料的应用提供实验依据。方法本研究经南京大学动物伦理委员会批准。通过组合光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂[lthium phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate,LAP]、GelMA、BMSCs构建光固化复合生物水凝胶GelMA/BMSCs,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)和能量色散X射线光谱仪(energy disper-sive X-ray spectroscopy,EDX)检测GelMA凝胶表面微观形态及元素构成,电子万能试验机测试凝胶压缩强度。将GelMA/BMSCs水凝胶在体外培养1、2、5 d后,通过CCK-8检测水凝胶包封的BMSCs细胞增殖活性,利用共聚焦显微成像技术观察其存活情况和细胞形态;在大鼠颅骨制备5 mm临界骨缺模型,经复合水凝胶治疗的为GelMA/BMSCs组,不做任何处理的为对照组。分别于术后第4、8周拍摄Micro-CT测算骨缺损面积和新生骨指标,第8周处死大鼠取缺损区颅骨样本进行H&E染色、Van Gieson染色和Goldner染色评价新生骨的质量。结果SEM观察到固化的GelMA内部呈现3D海绵状大孔凝胶网络,大孔形貌均匀,孔隙率为73.41%,孔径为(28.75±7.13)μm;EDX结果显示C和O均匀分布在水凝胶的网状大孔结构上;水凝胶压缩强度为152 kPa,GelMA/BMSCs培养第5天,镜下细胞形态铺展,从卵圆形变为梭形,CCK-8检测结果显示细胞增殖159.4%。术后第4周,Micro-CT三维重建图像显示对照组的骨缺损范围未见明显缩小,GelMA/BMSCs组骨缺损内部可见大量新骨生成;术后第8周,对照组骨缺损仍无明显变化,仅可见少量新生骨,GelMA/BMSCs组颅骨缺损基本愈合;第4周与第8周的定量分析发现,GelMA/BMSCs组大鼠颅骨缺损处新生骨量(new bone vol-ume,BV)、骨体积分数(new bone volume/total bone volume,BV/TV)、骨表面积(bone surface,BS)、骨表面积组织体积比(bone surface/total bone volume,BS/TV)均优于对照组(P<0.05)。第8周组织学染色结果显示GelMA/BMSCs组骨缺损处形成连续且致密的骨组织,而对照组仅在缺损边缘可见少量不连续新骨生成,缺损处主要为纤维结缔组织。结论光固化水凝胶的干细胞疗法具有良好生物安全性,在诱导大鼠颅骨缺损区新骨形成的同时促进骨成熟,具有潜在的临床转化前景。

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞骨向分化能力影响的比较研究

目的:观察糖基化终末产物(AGEs)对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)及人颌骨骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)骨向分化能力的影响。方法:组织块法和有限稀释法克隆化培养hPDLSCs及hBMMSCs,流式细胞仪检测两种细胞表型分子表达,取第3代细胞分别在10μg/mL AGEs刺激下进行矿化诱导,于诱导的21 d,茜素红染色、十六烷基吡啶定量观察钙结节形成情况、诱导7 d,碱性磷酸酶染色观察ALP活性、实时定量聚合酶链反应(real time PCR)和Western blot检测成骨相关基因及蛋白表达情况。结果:流式细胞仪显示两种细胞均阳性表达CD44、CD146、stro-1、CD90。成骨诱导21 d后茜素红染色和定量分析显示,hPDLSCs AGEs组矿化能力低于对照组;而hBMMSCs AGEs组矿化能力高于对照组(P<0.05)。成骨诱导7 d后,ALP染色显示,两种细胞ALP活性变化趋势与茜素红定量分析相同;RT-PCR检测hPDLSCs中ALP、Runx-2、Col-1、Runx-2mRNA表达水平均低于对照组,而hBMMSCs中各基因均高于对照组(P<0.05)。Western blot检测显示,各组Runx-2蛋白表达趋势与RT-PCR结果趋势相同。结论:AGEs抑制hPDLSC的骨向分化,促进hBMMSC骨向分化。

龟鹿二仙胶含药血清诱导大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的作用及机制

目的观察龟鹿二仙胶含药血清诱导大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化的作用并探讨其机制。方法全骨髓贴壁法分离BMSCs,培养至F3代。MTT法检测龟鹿二仙胶含药血清增殖作用并确定最佳浓度;F3细胞分为10%FBS组、10%KB组、10%GLEXJ组和Classical组,检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)比活性,茜素红染色方法观察对BMSCs成骨分化的作用,RT-PCR方法和Western blot检测Fzd-2、Axin-2基因和蛋白表达的变化。结果 MTT结果显示浓度为10%的龟鹿二仙胶含药血清能促进BMSCs增殖;10%GLEXJ组和Classical组ALP比活性高于其余两组,差异有统计学意义(P<0.05);且随着时间的延长,增加更明显(P<0.05或P<0.01),茜素红染色见橘红色钙结节着色;10%GLEXJ组Fzd-2 m RNA和蛋白表达水平显著高于其余各组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);10%GLEXJ组Axin-2 m RNA和蛋白表达水平显著低于10%FBS组和10%KB组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论龟鹿二仙胶含药血清能促进BMSCs增殖并诱导其向成骨细胞分化,其机制可能与增强Fzd-2表达、抑制Axin-2表达和激活Wnt/β-catenin通路密切相关。

非小细胞肺癌转移预测指标的Logistic回归分析

目的 研究预测非小细胞肺癌(Non smallcelllungcancer,NSCLC)转移的较为合适的方法和指标,并建立Logistic回归模型。方法 通过免疫组化、ELISA、酶谱电泳等方法对NSCLC患者的血清、尿液和骨髓等进行检查,并对数据进行Logistic回归分析。结果 血清MMP- 2、MMP- 9和尿液MMP- 2、MMP -9及骨髓微小转移灶与NSCLC转移危险有关(P <0 .0 5 )。其中尿液MMP- 2、骨髓微小转移灶对NSCLC转移有显著回归效果而选入回归方程。概率模型判断总符合率为6 3.8%。结论 对NSCLC患者进行尿液MMP -2、骨髓微小转移灶检查有实际应用价值,它们能提供NSCLC转移信息,为NSCLC的治疗和预后带来帮助。

转染bFGF基因对人骨髓间充质干细胞增殖特性的影响

目的 探讨作为组织工程种子细胞的人骨髓间充质干细胞,在体外培养条件下转染bFGF基因对其增殖特性的影响.方法 利用脂质体将含人pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代人BMSCs,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR和免疫荧光检测转染bFGF的骨髓间充质干细胞bFGF基因及其产物的表达,MTY法检测和流式细胞仪检测细胞的增殖情况和细胞增殖周期,并将转染和非转染BMSCs分别成骨诱导分化,对其碱性磷酸酶活性进行测定.结果 脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染BMSCs,经荧光定量PCR和免疫荧光检测.证实转染细胞表达bFGF.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高（P〈0.05）.碱性磷酸酶活性检测结果表明转染细胞的碱性磷酸酶活性高于非转染细胞（P〈0.05）.结论 用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的hBMSCs,bFGF基因改良的BMSCs可以改善其生存状态、促进其增殖,并可促进向成骨细胞分化.

新型钛表面微纳米共存梯度仿生结构对骨髓间充质细胞黏附、增殖及成骨分化的影响

目的制备一种新型微纳米共存梯度仿生表面结构,并探究其对骨髓间充质细胞生物学活性的影响。方法通过放电等离子烧结法和阳极氧化处理分别在纯钛表面(纯钛组)制备微米骨小梁样结构(微米骨小梁组)和TiO2纳米管形貌(TiO2纳米管组);再通过阳极氧化法在微米骨小梁样结构上制备TiO2纳米管结构,形成新型微纳米共存梯度仿生表面结构,命名为微纳米复合钛组。应用扫描电子显微镜(scanning elec⁃tronmicroscopy,SEM)和原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)、接触角(contact angle,CA)测量对纯钛组、微米骨小梁组、TiO2纳米管组和微纳米复合钛组进行表征观察。将大鼠骨髓间充质细胞(bone marrow mesenchymal cells,BMMCs)接种于4组材料上,SEM观察细胞黏附情况;MTT法检测细胞在材料表面增殖能力;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测细胞在材料表面分化能力;共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)下观察细胞黏附、免疫荧光检测相关蛋白肌动蛋白(F⁃actin)、黏着斑蛋白(vincu⁃lin)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达;qRT⁃PCR观察细胞成骨转录因子RUNX2、OCN、OPN、I型胶原(collagen I,COLI)表达情况。结果微纳米复合钛组表面亲水性最好(CA为9°±2.1°);MTT结果示5~9 d,微纳米复合钛组和TiO2纳米管组的细胞增殖活性显著高于纯钛组和微米骨小梁组(P<0.001);ALP结果示14 d时,微纳米复合钛组表面ALP活性最高;CLSM结果示培养24 h后,微纳米复合钛组肌动蛋白(F⁃actin)染色最深;培养72 h后,微纳米复合钛组OCN、OPN表达强于微米骨小梁组和TiO2纳米管组。qRT⁃PCR结果示TiO2纳米管组和微纳米复合钛组表面细胞所有成骨转录因子RUNX2、OCN、OPN、COLI的基因表达水平强于纯钛组和微米骨小梁组,其中I型胶原COLI基因表达水平差异有统计学意义(P<0.001)。结论微纳米复合钛这种新型微纳米共存梯度仿生表面结构能有效促进骨髓间充质细胞黏附、增殖及成骨向分化。

Sirt3在BMSCs成骨成脂双向命运分化调控的作用

为探究Sirt3(Sirtuin 3)对骨形成过程中BMSCs成骨成脂双向分化的调控作用以及影响因素,本文通过组织学方式以及体外细胞培养的方式两种方式进行检测和验证.利用6个月的野生型小鼠和Sirt3基因敲除小鼠的长骨骨髓进行组织学切片染色,对骨髓中的成骨标志物Osterix进行免疫荧光染色,以及对成脂标志物Cebpα和Pparγ进行免疫荧光染色.同时观察Sirt3敲除对骨髓中炎症标志物IL-1β、IL-6、TNF-α的影响.同时对从小鼠骨髓提取出的BMSCs原代培养后,通过ELISA检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量.成骨诱导后,通过碱性磷酸酶活性检测和茜素红染色,以及Western blot检测ALP、RUNX2、OCN的蛋白表达情况,探究Sirt3敲除对成骨分化的影响.而在成脂诱导BMSCs后,通过油红O染色和Western blot检测Cebpα和Pparγ的蛋白表达情况,研究Sirt3敲除对成脂分化的影响.以上结果表明敲除Sirt3基因会导致成年小鼠成骨降低成脂增加的不同方向分化的趋势,同时发现Sirt3敲除后炎症因子分泌显著上调,因此炎症可能作为Sirt3调控BMSCs成骨成脂双向命运分化的机制之一.

壳聚糖／硫酸葡聚糖／重组人骨形态发生蛋白-2微球对大鼠骨髓基质干细胞增殖与分化的影响

目的 探讨壳聚糖（CS）/硫酸葡聚糖（DS）/重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）微球对大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）增殖与分化的作用. 方法 采用离子交联法制备CS/DS/rhBMP-2微球.取SD大鼠体外培养传至第3代的BMSCs-C57.实验分为4组（n=4）：CS/DS/rhBMP-2微球组加入CS/DS/rhBMP-2微球,rhBMP-2组加入rhBMP-2,CS/DS组加入CS/DS微球,空白对照组.分别于培养2、4、6d应用四甲基偶氮唑盐比色法测定各组细胞的增殖情况;于成骨诱导培养1、3、5、7、9、11、14d采用碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒测定细胞ALP活性;于成骨诱导培养7、14d应用茜素红染色法检测各组细胞钙结节的生长情况.结果 培养2、4、6d,各组之间BMSCs-C57的OD值比较差异均无统计学意义（P＞0.05）.成骨诱导培养3d时,CS/DS/rhBMP-2微球组BMSCs-C57的ALP活性低于rhBMP-2组,差异有统计学意义（P＜0.05）,但是培养5d后,CS/DS/rhBMP-2微球组BMSCs-C57的ALP活性明显高于rhBMP-2组、CS/DS组和空白对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.成骨诱导培养7d,CS/DS/rhBMP-2微球组和rhBMP-2组有钙结节形成,而CS/DS组和空白对照组无钙结节形成;培养14d,CS/DS/rhBMP-2微球组和rhBMP-2组钙结节形成明显,而CS/DS组和空白对照组虽然出现了钙结节,但不明显. 结论 CS/DS/rhBMP-2微球对BMSCs-C57的增殖无明显作用,但具备良好的BMSCs-C57成骨诱导及分化作用.

骨髓单个核细胞移植后心肌梗死区细胞因子mRNA表达的实验研究

目的观察猪自体骨髓单个核细胞移植后心肌梗死区干细胞因子、基质细胞衍生因子-1、E-选择素、细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附因子-1等细胞因子mRNA的表达。方法前降支球囊封堵法建立10头猪急性心肌梗死动物模型，按随机数字表法分为对照组（5头）和移植组（5头）。造模1周后，移植组冠脉内移植自体骨髓单个核细胞，对照组注射1640培养基作为对照。6个月后取梗死区心脏组织观察局部细胞因子的mRNA表达。结果移植组梗死区能检测到基质细胞衍生因子-1、干细胞因子、E-选择素、细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1等细胞因子的mRNA。其表达强度明显高于对照组。结论干细胞移植能促进局部的基质细胞衍生因子-1、干细胞因子、E-选择素、细胞间粘附分子-1和血管细胞粘附分子-1mRNA的表达。