High expression of human clotting factor IX cDNA in the bone marrow stroma cells of hemophilia B patient

Hemophilia B, a serious bleeding disorder, is an inherited X chromosome-linked diseasecaused by the deficiency or inactiveness of human clotting factor IX (FIX). The conven-tional clinical treatment of plasma infusion is expensive and associated with a high risk

食蟹猴骨髓基质干细胞体外诱导分化的实验研究

为观察食蟹猴骨髓基质干细胞 (BMSC)体外培养及诱导分化情况 ,分离食蟹猴的BMSC ,以神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化。结果发现 ,分离得到的食蟹猴BMSC能在体外培养中增殖、分化 ,这些具有克隆能力的BMSC能表达神经干细胞特异性抗原Nestin,并能进一步诱导分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞 ,免疫细胞化学检测可见有GFAP和NSE抗原表达。提示灵长类BMSC是多分化潜能细胞 ,具有较强的自我更新和多分化能力 ,在适当的诱导分化条件下可形成具有神经系细胞 (神经元和神经胶质细胞)特征的细胞 ;

用组织工程方法修复山羊胫骨骨缺损的实验研究

制备组织工程用山羊胫骨骨缺损模型 ,研究用组织工程的方法修复山羊胫骨骨缺损的可行性。2 7只中国青山羊制备单侧胫骨中段 2 0mm的骨膜与骨缺损 ,7孔钢板内固定 ,随机分 3组 :空白组不进行植入处理 ;对照组 (CHAP组 )单纯植入羟基磷灰石 (CHAP) ;实验组 (CHAP/BMSc组 )植入CHAP与骨髓基质细胞 (BMSc)的复合物。术后 4、8、12周放射学检查X线片光密度指数比值、组织学方法评价各组骨缺损修复情况 ,12周CHAP/BMSc组与CHAP组做压应变与三点弯曲实验 ,评价骨缺损修复后的生物力学性质。结果显示 ,术后4、8、12周X线片光密度指数比值空白组无明显变化 ,CHAP组低于CHAP/BMSc组 (P <0 0 5 ) ;组织学切片显示CHAP/BMSc组成骨较CHAP组早、多 ;12周三点弯曲实验载荷、弯曲应力CHAP/BMSc组高于C组 (P <0 0 5 )。提示山羊胫骨 2 0mm骨与骨膜缺损不能自行修复 ,可满足骨组织工程大动物实验需要 ;CHAP与BMSc复合修复骨缺损在成骨时间、成骨量与质量上均优于单纯CHAP。

复方活血汤对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞粘附功能的影响

目的：研究常用活血化瘀中药对急性放射损伤小鼠骨髓基质细胞粘附功能的影响。方法：小鼠接受８ＧＹ６０Ｃｏγ射线照射后立即腹腔注射１００％复方活血汤液０．２ｍｌ，每天２次，连续６天，第７天取股骨骨髓制备有核细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｃｅｌｌ，ＢＭＣ）悬液，按长期骨髓细胞培养技术，第１２天计数成纤维细胞集落形成单位（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ－Ｆ），第２８天观察培养的基质细胞层对正常小鼠ＢＭＣ的粘附能力。结果：正常小鼠骨髓培养的基质细胞层粘附正常小鼠ＢＭＣ的能力为６７．８±１７．２％，复方活血汤组为５５．８±１０．５％，差异无显著意义（Ｐ＞０．０５）；对照组为４７．７±１３．６％，显著低于正常组（Ｐ＜０．０２）。结论：常用活血化瘀中药能增强急性放射损伤小鼠骨髓基质细胞粘附功能。

外周血干细胞移植前后骨髓微环境细胞粘附分子的临床研究

目的 初步探讨外周血干细胞移植预处理对骨髓造血微环境影响的分子机制。方法 采用流式细胞仪检测了 4 2例患者接受外周血干细胞移植预处理前及移植后 30、90、1 80d骨髓微环境基质细胞表达血管细胞粘附分子 (VCAM 1 )、纤维连接素 (Fn)、层粘素 (Ln)和Ⅳ型胶原 (ColⅣ )等细胞粘附分子水平的变化。结果 移植前接受单纯化疗方案预处理的患者 (简称单化组 )骨髓基质细胞表达VCAM 1、Fn、Lm和ColⅣ的水平以移植后 90d最低 ;移植前接受化疗 +全身放疗方案预处理的患者 (简称化放组 )骨髓基质细胞表达VCAM 1、Fn、Lm和ColⅣ的水平以移植后 30d最低 ;至移植后 1 80d ,单化组和化放组患者骨髓基质细胞表达VCAM 1、Fn、Lm和ColⅣ等指标仍未恢复到移植预处理前的水平 ,且放化组骨髓基质细胞表达上述细胞粘附分子水平的恢复过程较单化组缓慢。结论 造血干细胞移植前接受大剂量化 /放疗预处理后骨髓基质细胞表达细胞粘附分子的功能障碍可能与移植后某些患者造血功能恢复过程缓慢有关。

人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的真核表达载体,并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法:利用基因克隆技术,将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用 BamH I和Xho I双酶切后,再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导,用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞,然后以G418筛选阳性克隆,用免疫细胞化学鉴定。结果:经酶切鉴定及基因测序证实,重组体中已插入目的基因片段VEGF165。免疫细胞化学证实,重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论:成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165,并在骨髓基质细胞中得到表达,为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。

bFGF基因修饰的骨髓基质细胞复合多孔矿化Bio-Oss胶原修复下颌骨缺损的实验研究

目的:观察经bFGF基因转染的兔骨髓基质细胞复合多孔矿化Bio-Oss骨胶原修复下颌骨缺损的效果。方法:标准成年新西兰白兔12只随机分3组,单纯Bio-Oss骨胶原组,BMSCs+凝胶+Bio-Oss骨胶原组,bFGF基因转染BMSCs+胶原+Bio-Oss骨胶原组于术后8周取材,行肉眼、组织学观察骨缺损的修复情况。结果:单纯Bio-Oss骨胶原材料组:缺损区大量的未吸收的支架材料周围可见有类骨样组织;BMSCs+凝胶+Bio-Oss骨胶原材料组:缺损区大量的未吸收的支架材料周围可见有大量间充质细胞聚集、分化,有较幼稚的编织骨形成;bFGF基因转染BMSCs+凝胶+Bio-Oss骨胶原材料组:支架材料周围,大量新骨形成,新骨表面可见活跃的成骨细胞,部分区域有成熟骨组织形成,并有新生的毛细血管形成。结论:Bio-Oss骨胶原有较强的诱导成骨能力;Bio-Oss骨胶原为载体的自体骨髓基质细胞移植能有效修复骨缺损,是骨组织工程良好的支架材料;兔骨髓基质细胞体外表达人bFGF基因,并且经基因修饰的组织工程骨修复骨缺损效果最佳。

体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性

目的 :研究体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性及其成骨细胞表型特征。方法 :分离大鼠四肢长骨骨髓基质细胞 ,常规和矿化培养液培养 ,测定细胞生长曲线 ,碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、重组人骨形成蛋白 -2 (rhBMP -2 )及矿化培养液对骨髓基质细胞碱性磷酸酶 (ALP)活性的影响 ,观察矿化结节的形成。结果 :大鼠骨髓基质细胞群体倍增时间 (DT )为 66.1h ;在矿化液培养条件下细胞DT为 5 0 .3h。bFGF和rhBMP -2均不同程度增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶的活性。矿化液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用 ,用茜素红染色法显示较多的深红色矿化结节 ;常规培养条件下大鼠骨髓基质细胞生长虽呈现密集单层 ,没有矿化结节形成。结论 :大鼠骨髓基质细胞在体外可以稳定传代培养 ,在矿化培养液诱导培养条件下可以向成骨细胞分化 ,bFGF和rhBMP -2有助于骨髓基质细胞表现成骨细胞表型特征 ,提示骨髓基质细胞在骨移植研究领域有重要的应用价值。

骨髓基质细胞复合多孔矿化Bio-Oss骨胶原移植修复下颌骨缺损的实验研究

目的:探讨以多孔矿化Bio-Oss骨胶原为载体的自体骨髓基质细胞移植修复下颌骨缺损的效果.方法:标准成年新西兰白兔16 只随机分2 组,一组抽取骨髓基质细胞进行培养,矿化诱导后,细胞悬液与凝胶混匀滴入Bio-Oss胶原骨块中, 静置于37℃,50 ml/L的CO2培养箱中温育4～6 h,加入DMEM成骨条件培养液培养.然后修复下颌骨极限骨缺损.另组单纯Bio-Oss胶原块,修复下颌骨极限骨缺损.分别于术后8 周和12 周取材,分别行大体、X射线、组织学观察骨缺损的修复情况.结果:术后12 周,(1)BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原组,基本上由新生骨组织所修复.(2)单纯Bio-Oss胶原组大部分由纤维组织填充,周围骨形成明显,中央少量骨痂形成.结论:(1)Bio-Oss骨胶原有较强的诱导成骨能力;(2)Bio-Oss骨胶原为载体的自体骨髓基质细胞移植能有效修复骨缺损,是骨组织工程良好的支架材料.

成年大鼠骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞不同方法比较的研究

目的 研究成年大鼠骨髓基质干细胞 (BMSCs)诱导分化为神经元样细胞不同的方法 ,寻找它向神经细胞分化的最佳条件。 方法 取纯度较高的BMSCs,通过不同的神经营养因子诱导法和抗氧化剂诱导法 ,进行抗巢蛋白 (nestin)、神经元特异烯醇化酶 (NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、酪氨酸羟化酶 (TH)免疫细胞化学染色 ,观察相应的阳性细胞数。结果 诱导第 3天A组 (EGF :表皮生长因子 ,bFGF :碱性成纤维细胞生长因子 ,RA :全反式维甲酸 ) ,B组 (GDNF :胶质细胞系源性神经营养因子 ,BDNF :脑源性神经营养因子 ) ,C组 (EGF ,bFGF ,GDNF ,BDNF和RA)的Nestin阳性细胞数较多 ,其中以C组最多 ,而D组 (抗氧化剂 )Nestin阳性细胞数少于前三组。A ,B ,C组的NSE ,GFAP染色阳性细胞数较D组少 ,但D组有部分细胞发生死亡。诱导第 7天A ,B ,C组的NSE ,GFAP阳性细胞数较第 3天时明显增多 ,C组最多 ,B组其次 ,Nestin阳性细胞数比例较第 3天时明显减少。而D组的NSE ,GFAP阳性细胞数少于其第 3天时 ;C组诱导成神经细胞比例较高 ,阴性对照组和空白对照组极少或无阳性细胞。此外 ,神经营养因子诱导法生成神经样细胞的比例都多于胶质样细胞。 结论 抗氧化剂诱导法分化诱导快 ,而神经营养因子诱导法分化诱导效率高 。

VEGF_(121)转染对诱导后血管内皮细胞增殖的影响

目的探讨VEGF基因转染对VEGF诱导后血管内皮细胞生物学功能的影响,为组织工程血管构建提供血管内皮细胞的可能性。方法应用VEGF体外诱导兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化成血管内皮细胞后,再通过脂质体介导的方法将pCDI/VEGF121转染分化后的血管内皮细胞,通过MTT及流式细胞仪检测转染前后细胞的增殖与凋亡能力。结果诱导培养2周后兔骨髓基质细胞转化为血管内皮细胞,VEGF基因转染血管内皮细胞后表达VEGF蛋白,转染后细胞增殖能力增加,凋亡能力下降。结论转染VEGF是促进VEGF诱导血管内皮细胞增殖的有效途径,可望为组织工程血管构建提供血管内皮细胞衬层,为人工血管内皮化开辟一种新的途径。

多细胞因子诱导成年鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的实验研究

目的观察大鼠骨髓基质细胞(rBMSCs)的生长特点及诱导条件下分化成神经细胞的能力,并对其机制进行初步探讨。方法以密度梯度离心分离骨髓基质细胞,在神经干细胞培养液中培养,采用四唑盐(MTT)法观察在培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)对BMSCs增殖的影响;观察添加脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)和维甲酸(RA)对rBMSCs的诱导分化情况;采用免疫组织化学法(ABC)检测诱导后的细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元核蛋白(NeuN)和胶质原性纤维酸性蛋白抗体(GFAP)等特异性标志物的情况;以流式细胞分选确定神经元的比例。结果bFGF和EGF能在体外促进rBMSCs增殖,BDNF、NGF和RA能诱导rBMSCs来源的神经干细胞(NSCs)表达NSE、GFAP等特异性标志物。结论EGF、bFGF、BDNF、NGF、RA及适宜的培养液可使rBMSCs定向转化为NSCs,获得足够的目的细胞,进而分化为神经元样和神经胶质样细胞。

转化生长因子-β1基因治疗对种植体周骨质疏松的影响

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)基因治疗对种植体周围骨质疏松和骨缺损的影响。方法构建pCDNA3.1(+)-TGF-β1真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并与聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)体外黏附。制备骨质疏松大鼠股骨植入钛种植体模型,将24只Wister大鼠随机分为实验组、对照组和空白对照组,实验组为在种植体周骨缺损处植入TGF-β1基因修饰BMSCs复合PLGA;对照组为BMSCs复合PLGA。术后第4和8周取标本行免疫组化和组织学分析,观察种植体周骨组织中TGF-β1的表达和组织学变化。结果术后第4周,实验组骨缺损区的TGF-β1表达较对照组和空白对照组明显;第8周实验组骨缺损区被新生骨充填,骨质较对照组和空白对照组明显改善。结论TGF-β1基因修饰BMSCs体内回植后,可在种植体周围骨组织内表达TGF-β1,并可以影响种植体周骨缺损的修复和骨质疏松状况。

天然珊瑚和同种异体脱钙骨基质作为骨组织工程支架的细胞相容性研究

目的 :评价天然滨珊瑚 (NC)和同种异体脱钙骨 (DBM)的细胞相容性 ,探讨其作为骨髓基质细胞的支架载体构建骨组织工程的可行性。方法 :应用体外复合骨髓基质细胞培养法 ,通过倒置显微镜和MTT比色法 ,并对测量结果进行统计学分析 ,研究生物材料对骨髓基质细胞的形态、增殖的影响。结果 :两种材料对骨髓基质细胞形态均未见不良影响 ;NC在各培养时间对骨髓细胞增殖没有明显影响 (P >0 .0 5) ,DBM对骨髓细胞增殖均起促进作用 (P <0 .0 1)。结论 :两种材料均具有良好的细胞相容性 。

地甘口服液对环磷酰胺损伤小鼠骨髓CFU-F的影响

观察了地甘口服液对环磷酰胺损伤小鼠骨髓基质细胞形成的影响。将小鼠经尾静脉注射环磷酰胺(每次 10 0 mg/ kg· d-1,连续 3天 ) ,后予地甘口服液 号 (浓度 10 0 % ) 、 号 (浓度 2 0 0 % ) ,灌服 ,每日 2次 ,连续 7天。第 8天处死小鼠 ,取股骨 ,制备骨髓细胞悬液 ,并计数之后 ,建立小鼠骨髓长期培养体系 ,第 1 4天计数成纤维细胞集落形成单位 ( CFU- F) 。结果表明 ,正常小鼠 CFU-F为2 0 .6 5± 2 .96 ,模型鼠为 1 1 .3 8± 4 .93 ,两者有显著性差异 ( P<0 .0 1) ;地甘口服液 号和 号 CFU-F分别为 1 8.0 5± 1 .4 1和 1 8.79± 1 .88,均与正常组无差异 ( P>0 .0 5 ) 。故得出地甘口服液有益气养血之功效 ,可促进环磷酰胺损伤小鼠 CFU-F的形成。

川芎嗪对骨髓移植小鼠造血细胞SDF-1表达水平的影响

为探讨川芎嗪对骨髓移植 ( BMT)后造血重建过程中基质细胞来源因子 ( SDF- 1)的作用 ,建立了典型同基因 BMT小鼠模型 ,胃饲川芎嗪注射液每次 2 mg,2次 / d,分别于 BMT后第 7、 14 d计数外周血细胞骨髓单核细胞( BMNC)并测定骨髓组织切片中 SDF- 1的表达。结果表明 :川芎嗪组 BMT后第 7、 14 d外周血细胞计数、BMNC计数及骨髓组织切片中 SDF- 1表达水平均高于 BMT组。提示 :川芎嗪能在骨髓移植造血重建早期促进骨髓基质细胞表达SDF- 1,可能是促进 BMT后造血干细胞 ( HSC)回髓、加速造血重建的机制之一。

大鼠骨髓基质细胞体外培养诱导成骨能力的研究

目的:观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养生长时的生物学特性,及诱导分化为成骨细胞的能力。方法:取成年大鼠2只,处死后分离、培养骨髓基质细胞,第8天时添加矿化液诱导培养,细胞经传代后绘制生长曲线。应用倒置相差显微镜、透射电镜观察其生长特性,并进行甲苯胺蓝染色,VonKossa染色,碱性磷酸酶染色。结果:培养的大鼠骨髓基质细胞呈成纤维细胞样生长,增殖活跃。经诱导后,细胞碱性磷酸酶活性高,连续培养30天,Von-Kassa染色显示有局灶状钙盐沉积。结论:MSCs易于分离培养,体外扩增速度快,在矿化条件下,骨髓基质细胞在体外即具有很强的成骨能力,为研究其作为骨组织工程种子细胞植入体内成骨奠定基础。

骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化后超微结构和细胞因子表达的变化,为下一步细胞移植治疗扩张型心肌病提供理论依据。方法在体外扩增、定向诱导骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的基础上,电镜下观察骨髓基质干细胞诱导前后超微结构的改变,RT-PCR检测心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC的表达,并与原代培养的心肌细胞比较,观察二者之间的生物学异同。结果免疫组化法证实诱导后的骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化,电镜下胞浆内可见糖原颗粒,肌原纤维排列与原代培养的心肌细胞相似;RT-PCR证实诱导后的骨髓基质干细胞表达心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC。结论骨髓基质干细胞经5-氮胞苷定向诱导后在超微结构和细胞因子的表达上类似于心肌细胞,已向心肌样细胞分化。

神经生长因子对大鼠骨髓基质细胞成骨向分化的影响

目的:观察神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响。方法:5周龄雄性SD大鼠,贴壁法培养股骨、胫骨BMSCs。实验分为空白对照组、NGF组、K252a+NGF组和K252a组。在加入NGF前,按分组加入酪氨酸激酶A(TrkA)受体特异性抑制剂K252a孵育30min。通过MTT法检测24h、48h和72h细胞增殖情况,PNPP法检测成骨诱导3d、5d和7d细胞碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性,茜素红S钙染法观察成骨诱导14d矿化结节量。结果:同一观察时间点,4组之间BMSCs的增殖差异无统计学意义。成骨诱导3d、5d,NGF组ALP水平显著高于空白对照组(P<0.5);与NGF组相比,K252a+NGF组ALP水平显著降低(P<0.05);7d时,它们之间差异无统计学意义。成骨诱导14d,NGF组钙结节数量和面积显著高于空白对照组;阻断TrkA受体后,K252a+NGF组钙结节数量和面积明显降低。结论:NGF可能通过TrkA受体,在一定程度上促进大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化、增强其矿化能力,且此促进作用可以被TrkA受体抑制剂K252a阻断;阻断TrkA受体与否,NGF均不能促进大鼠骨髓基质细胞增殖。

TRAIL对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226黏附和凋亡的影响及其作用机制的初步探讨

本研究探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL对人多发性骨髓瘤细胞系RMPI8226的生长抑制作用,对细胞黏附和凋亡的影响及其作用机制。用MTT法检测TRALL对RPMI8226黏附功能和生长的影响;用AnnexinⅤ/PI检测细胞凋亡;流式细胞学检测细胞表面黏附分子的表达;RT-PCR法测定凋亡相关基因表达水平和Western blot法检测凋亡相关蛋白表达。结果表明:TRAIL抑制RPMI8226细胞生长;可诱导RPMI8226细胞凋亡,并伴有抗凋亡基因Mcl-1、XIAP、cFLIP、CARP1、CARP2和Bcl-2mRNA表达水平下降,促凋亡基因Bax mRNA表达水平升高;RPMI8226细胞内的凋亡执行蛋白caspase-3和NF-κB P65(RelA)表达水平随TRAIL浓度的增加而下降。此外,TRAIL明显上调了RPMI8226细胞表面黏附分子CXCR4的表达。结论TRAIL上调人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞表面的黏附分子CXCR4表达水平。TRAIL可诱导人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226凋亡。在一定的浓度范围内,TRAIL对人骨髓瘤细胞株RPMI8226的生长抑制呈时间-剂量依赖性。