同位素内标-超高效液相色谱-串联质谱法快速测定食品中米酵菌酸及异米酵菌酸

建立一种快速测定不同食品中米酵菌酸和异米酵菌酸的超高效液相色谱-串联质谱联用方法。样品中待测物用含0.1%氨水的甲醇-水溶液(体积比为4∶1)提取后,经过MFC335柱净化,BEH C_(18)色谱柱分离,负离子扫描,多反应监测模式检测,同位素内标法定量。两种待测物在0.5~200μg/L质量浓度范围内线性良好,相关系数均大于0.995,检出限和定量限分别为0.2、0.6μg/kg,平均回收率范围为90.6%~109.2%,测定结果的相对标准偏差为2.0%~11.2%(n=6)。该方法适用于各类食品基质中米酵菌酸和异米酵菌酸的快速筛查与公共卫生应急检测。

湿粉类制品生产工艺中米酵菌酸污染情况分析

目的:探索米酵菌酸在湿粉类制品生产工艺过程中的污染风险。方法:选取东莞市2家湿粉类制品企业作为监测点,于2021年7月至2022年6月期间,分4季度按生产工艺及流程共采集样品222份。其中食品类样品共99份,环境类样品共123份。对99份食品类样品进行米酵菌酸检测,并对222份样品进行唐菖蒲伯克霍尔德氏菌分离鉴定。对经生化鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的阳性菌株,进行椰毒假单胞菌酵米面亚种bon毒力基因检测;同时对阳性菌株进行产毒培养并灭菌,制备的提取液进一步检测米酵菌酸。结果:在99份食品类样品中检出3份米酵菌酸,分别来自1份巴基斯坦碎白米和由其制得的2份混合米浆(混合米浆2和混合米浆3);在222份样品中检出7株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,其中产毒株3株,分别来自1份缅甸碎白米和2份混合米浆(混合米浆2和混合米浆3);不产毒株4株。结论:进口碎米存在米酵菌酸污染风险,原料储存间和处理间的污染风险较大,生产工艺的源头--原料是重点污染环节,需重点关注,同时需重视生产环境的清洁消毒和加热工序的严格执行。

直接提取-超高效液相色谱-串联质谱法测定玉米酸汤子中米酵菌酸和异米酵菌酸

建立了直接提取-超高效液相色谱-串联质谱法测定玉米酸汤子中的米酵菌酸和异米酵菌酸的方法。样品经体积分数为5%的乙酸-乙腈溶液直接提取、离心、过滤后,采用Waters UPLC CSH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)分离,以体积分数为0.1%的甲酸-2 mmol/L甲酸铵水溶液作为流动相A,乙腈作为流动相B进行梯度洗脱,在电喷雾离子源负离子模式,多反应监测模式下进行扫描检测,以色谱峰面积外标法定量。结果表明,米酵菌酸和异米酵菌酸几乎无明显基质效应,且分别在质量浓度为1~100μg/L、0.1~10μg/L范围内与色谱峰面积线性关系良好,相关系数均不小于0.998,方法检出限分别为0.5、0.1μg/kg,米酵菌酸和异米酵菌酸的样品加标回收率分别为84.96%~92.87%、89.81%~104.77%,测定结果的相对标准偏差均小于10%(n=6)。该方法简单快速、灵敏度高、准确度好,具有较高的重现性,可作为玉米酸汤子中米酵菌酸和异米酵菌酸的定量测定方法。

HACCP体系在控制湿粉生产过程中米酵菌酸形成的应用

危害分析与关键控制点(HACCP)是一种针对食品生产加工过程控制的预防性管理体系,可以有效提升食品企业的食品安全管理水平。该研究以广州一家湿粉生产企业为示范研究,针对湿粉生产过程发生的椰毒假单胞菌污染及其代谢产生剧毒素米酵菌酸的危害进行潜在危害分析,确定了生产过程的关键控制点,建立关键控制点(CCP)的监控、纠偏与验证程序,并提出防控措施,制定HACCP计划表,通过HACCP体系应用加强对湿粉生产过程的管控,保障湿粉质量安全。

同位素内标-超高效液相色谱-串联质谱技术同时检测新鲜银耳中米酵菌酸和异米酵菌酸

采用同位素内标-超高效液相色谱-串联质谱技术,建立了一种能够快速、稳定地检测新鲜银耳中米酵菌酸与异米酵菌酸的分析方法。样品中加入自制的混合内标工作液后,用含3%乙酸的正己烷振荡提取,经Oasis MAX柱富集净化,利用Waters Acquity UPLC BEH C_(18)柱(50 mm×2.1 mm,1.7μm)进行分离,以乙腈-含0.1%甲酸的水溶液为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾负离子多反应监测模式进行扫描,内标法定量。结果显示,米酵菌酸与异米酵菌酸在1~100 ng/mL范围内的线性关系良好,相关系数的平方(r^(2))均大于0.999,方法的检出限和定量限分别为0.25和0.5μg/kg。在0.5、5、50μg/kg 3个浓度加标水平下,平均加标回收率为94.2%~107.3%,相对标准偏差为2.2%~5.7%。该法准确、灵敏、快速,适用于新鲜银耳中米酵菌酸与异米酵菌酸的检测。

米酵菌酸单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立鲜湿米粉中米酵菌酸(bongkrekic acid,BA)的免疫学快速检测方法,制备特异性识别BA的单克隆抗体并进行评价。方法利用碳二亚胺[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC]法将BA半抗原与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和卵清蛋白(ovalbumin,OVA)载体偶联,分别合成BA免疫原(BA-BSA)和包被原(BA-OVA),用BA-BSA免疫Balb/C小鼠,取免疫效果好的小鼠脾脏与小鼠NS-1骨髓瘤细胞进行融合。采用间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)进行筛选,筛选出能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞,利用有限稀释法进行亚克隆得到单株能稳定分泌所需抗体的细胞;采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。利用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水型抗体,通过酶联免疫吸附法测定纯化后的抗体效价。结果成功合成了BA免疫原BA-BSA和BA包被原BA-OVA,筛选获得BA杂交瘤细胞株BA-3F1E9,单克隆抗体的效价为1×10^(5)。结论本研究建立了制备高特异性BA单克隆抗体的方法,为开发鲜湿米粉中BA快速检测试剂盒提供了理论依据。

三重四级杆液质法检测食品中毒黄素和米酵菌酸含量

旨在建立利用三重四级杆液相色谱质谱(UPLC-MS/MS)同时测定食品中毒黄素和米酵菌酸含量的方法。样品在80%甲醇水溶液体系中萃取,离心后上清液经QuEChERS EMR-Lipid净化处理,浓缩、复溶后,以0.1%甲酸水和乙腈为流动相经梯度洗脱,液质电喷雾离子源正负模式检测,使用外标法进行定量分析。实验结果显示,毒黄素和米酵菌酸在浓度为0.5~100μg/L的范围内表现出较好线性关系,线性线性相关系数r大于0.995,在不同基质多水平添加浓度下,回收率为86.8%~103.6%,相对标准偏差(RSD)小于5%,毒黄素方法检出限为0.1μg/kg,定量限为0.2μg/kg,米酵菌酸方法检出限为0.05μg/kg,定量限为0.1μg/kg。该方法灵敏度高、专属性好、准确可靠,适合食品中毒黄素和米酵菌酸含量的测定。

椰毒假单胞菌酵米面亚种产毒差异蛋白质组学分析

为了从蛋白质水平探索椰毒假单胞菌米酵菌酸毒素产生机制,采用数据依赖型采集(data dependent acquisition,DDA)非标记定量蛋白质组学技术对该菌产毒培养前后蛋白质变化进行了分析。结果显示:产毒培养后,产毒株中显著性上调表达蛋白25个,显著性下调表达蛋白31个,其中显著性上调表达的蛋白中有与细菌趋化性信号转导相关的ABC转运蛋白、反应调节受体蛋白、甲基受体趋化性蛋白Ⅱ,以及与细菌运动相关的鞭毛蛋白如鞭毛P环蛋白、鞭毛M环蛋白、鞭毛钩蛋白FlgE等,推测趋化性运动可能在椰毒假单胞菌米酵菌酸毒素产生过程中发挥重要作用。椰毒假单胞菌米酵菌酸毒素产生机制研究,可为人们更好地降低食源性疾病的发生提供理论支撑。

超高效液相色谱-串联质谱法测定红曲中米酵菌酸

建立超高效液相色谱-串联质谱测定红曲中米酵菌酸残留的分析方法。样品经80%甲醇水溶液(含1%氨水)超声提取,取上清液5 mL经MAX强阴离子固相萃取小柱净化,采用Welch Botimate C_(18)色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.6μm),以乙腈-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液为流动相梯度洗脱,流量为0.3 mL/min,柱温为35℃,进样体积为1μL,采用电喷雾负离子源电离,以多反应监测模式采集信号。米酵菌酸的质量浓度在5.02~1004 ng/mL范围内与定量离子丰度有良好的线性关系,线性相关系数为0.9997。样品加标平均回收率为82.3%~96.1%,测定结果的相对标准偏差为0.6%~4.5%(n=6),方法检出限和定量限分别为0.8 ng/g和2.0 ng/g。该方法快速、准确、灵敏,适用于红曲中米酵菌酸的测定。

湖南湿米粉中米酵菌酸的不确定度评定

评估超高效液相色谱-串联质谱法测定湖南湿米粉中米酵菌酸含量的测定不确定度。依据《化学分析中不确定度的评估指南》《测量不确定度评定与表示》以及《食品安全国家标准食品中米酵菌酸的测定》,超高效液相色谱-串联质谱法测定湿米粉中的米酵菌酸的含量,建立不确定度评定的数学模型,并对不确定度来源进行分析和量化。湿米粉中含有米酵菌酸3.23μg/kg;合成相对标准不确定度为0.878μg/kg,k=2。不确定度评定的结果表明,当出现接近方法的定量限或检出限额检测结果时,应考虑其不确定度。

市售米酵菌酸快速检测产品的质量评价与分析

本研究选取湿米粉、河粉、凉皮为基质,采用空白基质加标方式制备样品,每个快检产品检测每种基质50份样品,依据《国家市场监管总局关于规范食品快速检测使用的意见》对2家市售米酵菌酸快检产品的一般性指标和技术性指标进行评价,共完成300批次样品检测。结果表明,本次米酵菌酸快检产品的检测效果较好,产品的特异性均为100%,灵敏度高于90%,相对准确度高于95%。

植物乳杆菌对米酵菌酸的吸附特性研究

为了探究植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)X1对米酵菌酸(Bongkrekic acid,BA)的吸附特性及其影响因素。本文采用高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)的方法测定菌体对米酵菌酸吸附率。实验考察了时间、温度、pH、菌体浓度、米酵菌酸浓度及在模拟胃肠道环境下对米酵菌酸吸附效果的影响,并对吸附过程进行热力学与动力学拟合。结果表明,菌株吸附米酵菌酸短时高效,1 h后达到饱和;温度、菌体浓度与米酵菌酸浓度升高均促进吸附进行且吸附后不易解吸。温度37℃、菌体浓度6 g·L^(-1)与米酵菌酸浓度10 mg·L^(-1)为最佳吸附条件,其吸附率分别为52.70%、54.12%与48.53%;酸性环境有利于米酵菌酸的吸附,pH为3时,吸附率与单位吸附量最高;在模拟胃液与肠液环境中吸附效果减弱。吸附过程符合Langmuir方程和准二级动力学方程,且为单分子层吸附。综合热力学与动力学分析可得,吸附为自发、放热的过程,并且同时存在物理吸附与化学吸附。因此,植物乳杆菌X1作为米酵菌酸吸附剂有潜在的应用潜力。

1株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在湿米粉中的产毒规律分析

目的:了解防腐剂(脱氢乙酸、ε-聚赖氨酸盐酸盐)和培养温度对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在湿米粉培养基上生长及产毒的影响。方法:以1株自食物中毒事件样品中分离得到的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)菌株为研究对象,分别接种至添加脱氢乙酸(1.0 g/kg)、添加ε-聚赖氨酸盐酸盐(0.25 g/kg)以及未添加防腐剂的湿米粉培养基中,置于10,26,36℃条件下培养,研究其在湿米粉中生长及产毒情况。采用修正的Gompertz模型构建初级生长模型。结果:在10℃条件下该菌生长缓慢且未产生米酵菌酸;在26℃条件下培养至96 h,该菌对照组和各试验组产生的毒素均超过500μg/kg,在添加脱氢乙酸的样品中最早产生米酵菌酸,其最高质量浓度(1 484μg/kg)略低于对照组(2 561μg/kg)和ε-聚赖氨酸盐酸盐组(2 762μg/kg);在36℃条件下该菌生长最为快速,各组产毒量均低于350μg/kg。结论:湿米粉在10℃贮存可有效降低产生米酵菌酸的风险,脱氢乙酸、ε-聚赖氨酸盐酸盐均未能阻止唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长和产毒,需进一步探索能起作用的防腐剂,制定多手段结合的控制措施。

1株椰毒假单胞菌酵米面亚种在湿米粉基质中的产毒情况和酸度分析

湿米粉是大众喜爱的食品,但近年来出现了湿米粉的食物中毒事件,因此研究椰毒假单胞菌酵米面亚种在湿米粉基质中的产毒情况和酸度变化,为湿米粉的加工储藏提供参考。将一株椰毒假单胞菌酵米面亚种的发酵菌液按照不同的初始浓度接种到湿米粉中,模拟生活中湿米粉的储存条件,测定不同温度和时间下湿米粉中的米酵菌酸浓度和酸度,分析椰毒假单胞菌酵米面亚种在湿米粉基质中的产毒情况、湿米粉的酸度变化。结果表明,在4℃条件下,培养72 h湿米粉未检出米酵菌酸,在26、36℃培养条件下的米酵菌酸浓度随着培养时间延长持续升高,且36℃湿米粉中的米酵菌酸含量均高于26℃。培养后的湿米粉,酸度无明显变化。污染了椰毒假单胞菌酵米面亚种的湿米粉基质中,米酵菌酸的产毒量随着污染菌液浓度和培养温度升高而升高,呈正相关,但酸度无明显变化。

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法快速定性、定量分析人全血中米酵菌酸

采集疑似米酵菌酸中毒患者全血样品200μL,加入已于-20℃冷冻的甲醇800μL,振荡5 min,离心5 min,上清液按照优化的仪器工作条件分析。在Infinity Lab Poroshell 120 EC-C_(18)色谱柱(150 mm×3.0 mm, 2.7μm)上以不同体积比的含10 mmol·L^(-1)甲酸铵的0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液和乙腈的混合溶液梯度洗脱分离米酵菌酸,以双喷射流电喷雾离子源负离子模式电离,以全离子采集一级质谱(MS1-Allions)模式定性鉴别,以基质匹配工作曲线法定量。结果显示,米酵菌酸的质量浓度在45~450μg·L^(-1)内与其对应的峰面积呈线性关系,检出限(3S/N)为3.2μg·L^(-1)。对空白全血样品进行3个浓度水平的加标回收试验,回收率为82.6%~90.1%,测定值的相对标准偏差(n=6)为4.5%~5.6%。方法应用于疑似中毒患者全血样品的分析,检出了米酵菌酸(检出量为2 225μg·L^(-1))。

胶体金免疫层析法快速检测食品中的米酵菌酸

制备特异性识别米酵菌酸的单克隆抗体,并以胶体金标记用作示踪物,建立胶体金免疫层析快速检测方法。研究胶体金标记体系pH值、抗原、抗体质量浓度、离子强度、表面活性剂以及样品前处理方法等对胶体金层析卡性能的影响。结果表明:在最适条件下,所建立的胶体金免疫层析方法对米酵菌酸的定量检出限为1.2μg/kg,线性范围1.8~7.2μg/kg,定性检出限16.0μg/kg。该方法特异性良好,与食品中常见的毒素无交叉反应,对银耳、木耳和米粉等样品的添加回收率在80.2%~101.2%之间,相对标准偏差小于6.4%,且结果与LC-MS/MS法一致。该方法具有准确、灵敏、简便、快速和低成本等特点,可以满足食品中米酵菌酸现场大批量筛查的需求。

超高压液相色谱—高分辨质谱联用仪检验血液中的米酵菌酸

本文建立了血液中米酵菌酸的LC-QTOF-MS检验方法。采用Kinetex C18(2.6μm,4.6X100mm)色谱柱,以水相A(0.1%(v/v)甲酸)和有机相B(乙腈)为流动相梯度洗脱,质谱采用电喷雾负离子全扫描模式,对血液中的米酵菌酸分析检验。方法回收率为87.06%~102%,线性回归方程为y=38.05x+35.219(R^(2)=0.9995),检出限为0.5ng·mL^(-1),定量限为5ng·mL^(-1)。

环境因素对吊浆粑中米酵菌酸含量的影响

探究唐菖蒲伯克霍尔德菌椰酵亚种(Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans,BGC)在吊浆粑中的产米酵菌酸(bongkrekic acid,BA)特征及环境温度、湿度对其产BA的影响。在吊浆粑样品中接种BGC,调整接种浓度(103、105、107 CFU/mL)、培养环境的温度(10±1、15±1、20±1、25±1、30±1和36±1℃)和湿度(20%、40%和60%),以高效液相色谱–串联质谱法测定不同条件下BA的含量。结果表明,各实验组的吊浆粑样品在培养1天后即可检出BA。当接种浓度为103 CFU/mL时,BGC在吊浆粑中产生并积累的BA含量高于接种浓度为105和107 CFU/mL的组别,组间差异为1~3μg/kg。较低温度(10±1、15±1和20±1℃)和较低湿度(20%)的环境可减少BGC在吊浆粑中产生BA。提示居民应食用新制作的吊浆粑,避免长时间贮存于高温、潮湿环境,以降低食物米酵菌酸中毒风险。

QuEChERS净化-高效液相色谱-串联质谱法测定吊浆粑中米酵菌酸的含量

提出了QuEChERS净化-高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定吊浆粑中米酵菌酸含量的方法。取2.0 g样品,加入10 mL水,涡旋1 min;然后加入10 mL含5%(体积分数)乙酸的乙腈溶液,涡旋1 min;再加入6.0 g无水硫酸镁和1.5 g无水乙酸钠,涡旋1 min,离心5 min。取5 mL上清液置于预装200 mg C_(18)和900 mg无水硫酸镁的15 mL离心管中,涡旋1 min。取2 mL上清液,于40℃氮吹至干,用1 mL 50%(体积分数)乙腈溶液复溶,涡旋1 min,经0.22μm尼龙滤膜过滤后进行HPLC-MS/MS检测。色谱分析中以不同体积比的0.1%(体积分数)甲酸溶液和甲醇的混合溶液为流动相进行梯度洗脱;质谱分析中以电喷雾离子源负离子模式电离,多反应监测模式检测,采用基质匹配的标准溶液绘制工作曲线,外标法定量。结果显示:米酵菌酸工作曲线的线性范围为1~200μg·L^(-1),检出限为0.75μg·kg^(-1);在5个加标浓度水平下,米酵菌酸的回收率为78.9%~112%,测定值的相对标准偏差(n=6)为4.2%~16%。

食品中米酵菌酸检测方法研究进展

基于米酵菌酸食品中毒事件频发的现状,本文总结了食品中米酵菌酸在提取纯化和检测分析技术方面的最新研究进展,以期为后续开发米酵菌酸的高效检测方法提供参考。