牛血红蛋白源抗菌肽P3及其类似肽的生物信息学分析

为研究牛血红蛋白源抗菌肽P3及其类似肽(JH-0、JH-1、JH-2、JH-3)的生物学功能,本研究利用在线软件分析了抗菌肽P3及其类似肽的生物信息学特性,发现这5个抗菌肽均带正电荷,等电点均大于8.00,均为疏水蛋白,定位于细胞外,不含有跨膜区、信号肽序列和糖基化位点,P3和JH-2的二级结构为α-螺旋+β-折叠,JH-3为100%的α-螺旋,JH-0和JH-1为无规则卷曲结构,P3、JH-2和JH-3在第13位氨基酸即苏氨酸(Thr,T)有一个糖基化位点。根据分析结果推测抗菌肽P3及其类似肽可作用于细胞壁或细胞膜,从而使菌体死亡。

牛抗菌肽Bac7-Bac5融合基因在大肠杆菌中的过表达,纯化及抑菌活性

牛抗菌肽Bac7和Bac5是一种线性阳离子小分子多肽,在机体天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。根据Gen bank中公布的牛抗菌肽bac7和bac5成熟肽基因序列,人工合成了融合基因Bac7-Bac5片段,克隆于原核表达载体pET32(a+)中构建了重组表达载体pET-B7-B5,将其转化于E.coli BL21(DE3)中实现了重组蛋白B7-B5(rB7-B5)的过表达,表达的rB7-B5以包涵体形式存在,rB7-B5表达量约占细菌总蛋白的36.6%,分子量大小为33kDa,与预测大小相符。以8mol/L尿素变性包含体后用Ni亲和层析柱纯化目的蛋白,经多步透析法复性的rB7-B5对猪胸膜肺炎放线杆菌和耐药性大肠杆菌具有很好的抑菌活性,为新型抗菌制剂的研制和开发奠定了基础。

一种广谱、低毒的抗菌肽类似物HJH-3的生物学活性和膜活性的测定

为了解牛红细胞抗菌肽(AMPs) P3的类似物HJH-3的活性、稳定性及潜在的作用机制,本研究采用微量倍比稀释法测定AMPs HJH-3对试验菌株的最小抑菌浓度(MIC);同时测定该AMPs对红细胞的溶血性;采用双层琼脂扩散法检测了HJH-3的稳定性;通过荧光探针-酶标仪分析技术和电镜技术检测了HJH-3潜在的膜作用机制。结果显示,HJH-3对与感染相关的不同细菌均具有广泛的抗菌活性,其在大于5 MIC时对红细胞的溶血作用比较低;HJH-3在耐受温度、酸碱度和离子强度等方面均具有很好的稳定性;在AMPs HJH-3的作用下,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜可以迅速去极化;电镜观察显示,HJH-3能够穿透大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞壁和细胞膜,并在其膜上形成孔洞,直接破坏了细胞的完整性,最终导致细菌的死亡。本研究证实了AMPs类似物HJH-3具有广谱的抗菌活性,其抗菌活性的发挥是通过改变正常细胞的跨膜电位和破坏细菌膜的完整性来实现的。本研究为AMPs HJH-3的开发应用奠定了实验基础。

牛气管抗菌肽的原核表达、体外抗菌活性及其组织分布分析

本文旨在对牛气管抗菌肽(tracheal antimicrobial peptide,TAP)基因进行原核表达,以及研究重组蛋白的抗菌活性,并分析TAP在各组织的表达分布情况,为开展转TAP基因抗乳腺炎奶牛研究提供技术资料。作者采用RT-PCR从荷斯坦奶牛气管扩增TAP基因,分析其序列后根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏好性,人工合成牛TAP基因,构建pET32a(+)-TAP重组质粒;然后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并纯化。对表达蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定;在线软件分析目的蛋白表达量。采用滤纸片法测定重组牛TAP的体外抗菌活性,并用RT-PCR法分析牛各组织中TAP表达情况。测序结果表明,扩增到114bp目的基因片段,可编码含38个氨基酸残基的成熟蛋白。SDS-PAGE分析表达的融合蛋白相对分子质量为24ku,重组蛋白以可溶性方式存在,表达量占菌体总蛋白的52.1%。Western Blot检测只出现单一条带。抗菌效价分析表明0.115μg·μL-1重组蛋白对牛源金黄色葡萄球菌有一定的抗菌活性。TAP基因在奶牛咽喉、肺、气管、小肠、肝、心脏及口腔黏膜中均有表达,在鼻黏膜和舌黏膜中微量表达,在皮肤中几乎不表达。作者成功表达了牛TAP基因,重组牛TAP蛋白在大肠杆菌中实现高效表达,并具有一定的抗奶牛乳腺炎致病菌的活性,为未来培育抗乳腺炎转基因奶牛及相关基因工程产品的开发奠定了基础。

高表达牛气管防御素的真核重组载体的构建及其鉴定

根据GeneBank中牛TAP的序列设计了1对特异性引物,采用RT-PCR方法从牛气管组织扩增牛TAP基因,并克隆到pEASY-T3载体。测序结果表明,扩增的片段含有144 bp核苷酸,编码48个氨基酸,与已报道的bTAP有1个氨基酸不同。该基因与真核表达载体FG9重组,经过PCR,酶切和测序鉴定,筛选牛TAP基因重组真核表达载体。使用脂质体法将FG9-TAP重组质粒转染293T细胞,斑点ELISA检测结果表明,成功构建了高表达牛TAP基因的真核表达载体,为抗金黄色葡萄球菌转牛TAP基因奶牛培育研究奠定基础。

牛血液白细胞源抗菌肽的纯化及活性鉴定

为了分离纯化牛白细胞中的抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)并对其体外抗菌活性进行初步分析,以中国荷斯坦奶牛血液为材料,通过离子交换层析法纯化抗菌肽,用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进一步纯化,用双层琼脂糖弥散法测定其抗菌活性。结果表明,通过离子交换层析获得的阳离子峰有抗菌活性,通过RP-HPLC对阳离子峰纯化后获得了6个峰;6个峰液对大肠杆菌和沙门氏菌均具有抗菌活性,峰液F1、F2和F3对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,仅峰液F1对白色念珠菌具有抗菌活性。

牛血红蛋白源抗菌肽BHP的生物信息学分析

为了解牛血红蛋白源抗菌肽BHP的基本信息,试验通过软件对BHP的生物信息学进行了分析。结果表明:BHP的等电点为9.53,分子质量为3 206.61 u,静电荷为2;为稳定的亲水多肽,定位于细胞外;没有跨膜区和信号肽,没有糖基化位点,有5个磷酸化位点和1个泛素化位点;二级结构主要由无规则卷曲组成,存在多个酶切位点。说明牛血红蛋白源抗菌肽BHP可与细菌细胞膜作用,从而致菌体死亡。

牛红细胞源抗菌肽的分离纯化与活性鉴定

【目的】分离纯化牛红细胞中的抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs),并对其体外抗菌活性进行初步检测。【方法】以中国荷斯坦奶牛血液为材料,通过离子交换层析法和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化抗菌肽,用琼脂糖平板扩散法测定其抗菌活性,并用质谱法测定其分子质量。【结果】牛血液红细胞粗提物经离子交换层析获得的阳离子峰有抗菌活性;阳离子峰经RP-HPLC纯化后,共得到4个峰(F1、F2、F3和F4),其对大肠杆菌均具有抗菌活性,F1峰和F3峰对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,仅F1峰对白色念珠菌具有抗菌活性;经质谱分析,F1峰纯化肽的分子质量为2 562.40 u。【结论】成功地从牛红细胞中分离纯化到了AMPs;F1峰中AMPs的抗菌谱较广,抗菌活性较强。

牛气管抗菌肽cDNA的克隆与表达

目的:开发一种有效抑制动物细菌感染的重组抗菌肽。方法:根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP) mRNA序列设计引物,用RT-PCR从奶牛气管上皮细胞总RNA中扩增出214bp的bTAP cDNA,将其克隆入pUCm-T载体进行序列测定,将此cDNA分别克隆入真核表达载体pcDNA3和原核表达载体pGEX-6p-1进行表达研究。结果:测序结果与已发表的bTAP序列有3个碱基差异,其中2个导致氨基酸替换;经微球菌溶解试验证明,注射在小鼠皮下的重组质粒pcDNA-tap能表达有活性的bTAP;抗体测定结果显示重组质粒pcDNA-tap经5次免疫后家兔产生的抗hTAP抗体效价达1:800;经IPTG诱导后,含重组质粒pGEX-tap大肠杆菌能表达预计大小的GST-bTAP融合蛋白,且能被兔抗bTAP识别。结论:本研究克隆的bTAP cDNA可用于表达研究及相关基因工程产品的开发。

牛源抗菌肽乳铁素的生物信息学分析

为研究牛源抗菌肽乳铁素的生物学功能,通过网络在线软件和工具分析了牛源抗菌肽乳铁素的生物信息学相关特性.结果表明:牛源抗菌肽乳铁素为不稳定的、带正电荷的亲水性蛋白多肽,没有跨膜区和信号肽,也没有糖基化位点和磷酸化位点,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,呈环形结构,定位于细胞外,可与19个蛋白分子发生相互作用.这为深入理解牛源抗菌肽乳铁素的生物学功能奠定了基础.

牛气管黏膜抗菌肽成熟肽基因的克隆及序列分析

目的:获得牛气管黏膜抗菌肽(bTAP)成熟肽的基因序列,为后续的研究工作奠定基础。方法:从新屠宰的黄牛气管黏膜中提取总RNA,反转录获得cDNA,以此cDNA为模板进行PCR扩增目的片段,并将其克隆至pMD18-T载体中,经鉴定随机挑选1个阳性重组子进行测序,将测序结果与已报道的序列进行比较,并做NCBIBlast比对。结果:PCR扩增出bTAP成熟肽基因,核苷酸序列测定验证了其正确性;NCBIBlast比对表明,与bTAP成熟肽基因同源性较高的分别是牛β-防御素11、牛β-防御素12、牛β-防御素402、牛β-防御素403、绵羊β-防御素1、绵羊β-防御素2、山羊β-防御素1及山羊β-防御素2,核苷酸序列同源性分别为78.07%、78.95%、80.70%、83.33%、83.33%、80.70%、81.58%和81.58%,氨基酸序列同源性分别为68.42%、65.79%、68.42%、76.32%、71.05%、63.16%、63.16%和68.42%。结论:成功克隆了bTAP成熟肽的基因序列,NCBIBlas比对表明bTAP与防御素可能来自一个共同的祖系基因。

荷斯坦牛红细胞抗菌肽的纯化及活性鉴定

以荷斯坦奶牛血液为原料,制备红细胞粗提物,通过离子交换层析和反相高效液相色谱法纯化抗菌肽,用琼脂糖弥散法测定其抗菌活性。结果表明:通过离子交换层析获得的阳离子峰具有抗菌活性,通过反相高效液相色谱对阳离子峰活性分布区域进行分离,获得了8个峰,8个峰对大肠杆菌均具有活性,F1、F3、F4、F5、F6和F8对金黄色葡萄球菌具有活性,F2、F4、F5、F6和F8对白色念珠菌具有活性。试验成功地从牛红细胞中分离纯化到了抗菌肽,其中,F6的抗菌谱较广、抗菌活性较好。

抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌的杀菌作用研究

为探究真菌防御素Plectasin衍生肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌的体外杀菌效果及其作用机制,本试验采用微量肉汤稀释法检测停乳链球菌CVCC 3938耐药性,通过NZ2114对停乳链球菌CVCC 3938最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)及在胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)培养基和全脂灭菌(ultra-high temperature instantaneous sterilization,UHT)牛奶中的杀菌动力学曲线的测定评价其抗菌特性;借助扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪观察NZ2114作用下的细菌形态变化;使用凝胶阻滞、荧光光谱和圆二色谱进一步分析NZ2114对细菌基因组DNA的作用。结果显示,停乳链球菌对氧氟沙星和四环素均产生耐药性,临床分离菌株则呈现多重耐药性,NZ2114对受试停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的MIC值为0.11~0.45μmol/L。抗菌肽在TSB培养基和全脂灭菌牛奶中均具有抑菌活性,且在短时间内(0.5~3 h)可使停乳链球菌菌落数下降3个数量级。扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪结果表明,抗菌肽NZ2114能够破坏停乳链球菌细胞膜,导致其内容物泄漏。凝胶阻滞、荧光光谱和圆二色谱证实抗菌肽穿过细胞膜后与细菌基因组结合,破坏了DNA,以此达到杀菌目的。上述结果表明,抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌杀菌活性强,其破坏菌体细胞膜后可直接作用于胞内的基因组DNA并改变其二级结构。由此可见,抗菌肽NZ2114是一种极具前景的治疗停乳链球菌引起乳腺炎的抗生素替代品。

牛血红蛋白β亚基片段衍生抗菌肽的分子设计及其抗菌活性分析

【目的】试验旨在获得分子质量小、溶血性低、稳定性好的抗菌肽。【方法】以牛血红蛋白β亚基的氨基酸序列为基础,以抗菌肽的构效理论为指导,筛选出1条多肽(YKK-18),并以其为模板肽设计了3条长度为18个氨基酸残基的改造多肽(LJ-1、LJ-2和DLK-3),通过最小抑菌浓度的测定反映4条多肽的抗菌活性,采用琼脂糖扩散法分析有抗菌活性多肽的热稳定性、酸碱稳定性、盐离子稳定性和反复冻融稳定性,用分光光度法测定有抗菌活性多肽的溶血性。【结果】设计的4条多肽均为带正电荷的亲水性多肽,与APD3数据库中收录的抗菌肽氨基酸序列相似性均低于50%,二级结构中均有较高含量的α-螺旋,改造多肽的两亲性程度均高于模板肽,模板肽对测试菌株没有抗菌活性,而改造多肽对测试的大肠杆菌、沙门菌、绿脓假单胞菌、葡萄球菌、白色念珠菌等均有不同程度的抗菌活性,其中DLK-3和LJ-1的抗菌活性优于LJ-2,但对奇异变形杆菌均没有抗菌活性,在100℃高温、pH 4.0~10.0、生理浓度的盐离子(Na~+、K~+、Ca、Mg、Fe、Cu)和14次反复冻融等条件下仍有较好的抗菌活性,DLK-3的溶血作用呈剂量依赖性,在200μg/mL时的溶血率已超过50%,而LJ-1和LJ-2的溶血率在高浓度(200μg/mL)时仍低于5%。【结论】本研究结果为抗菌肽的分子设计和改造提供了参考,获得的抗菌肽LJ-1和LJ-2具有成为抗生素替代物的潜力。

牛源cathelicidin类抗菌肽的生物信息学分析

为研究牛源cathelicidin类抗菌肽的生物学功能,通过生物信息学方法对牛源cathelicidin类抗菌肽的理化性质、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、二级结构和化学修饰等进行预测分析.结果表明:牛源cathelicidin类抗菌肽为阳离子型抗菌肽,等电点11.53～13.20;除了BMAP-27和Dodecapeptide为稳定的多肽外,其他抗菌肽均为不稳定多肽;BMAP-28和Dodecapeptide为疏水性多肽,BMAP-27、BMAP-34、Bac-4、Bac-5、Bac-7和Indolicidin为亲水性多肽;BMAP-27和BMAP-28由α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲构成,BMAP-34主要由α螺旋和β转角构成,Bac4、Bac7、Indolicidin和Dodecapeptide由无规则卷曲构成,Bac5由β转角和无规则卷曲构成;没有信号肽、跨膜区和糖基化位点,BMAP-27、BMAP-28和BMAP-34各存在1个丝氨酸的磷酸化位点.根据分析结果推测牛源cathelicidin类抗菌肽可作用于细菌的细胞壁或细胞膜,进而导致细菌死亡.

牛乳铁蛋白活性多肽LfcinB在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析

牛乳铁蛋白(LfcinB)是一种阳离子抗菌肽,具有抗细菌、抗肿瘤等多种生物学活性.本文探讨了利用SUMO(Small Ubiquitin-Related Modifier)融合标签在大肠杆菌系统中通过LfcinB串联表达策略制备重组LfcinB的方法.结果显示,大于90%的SUMO-(LfcinB)n蛋白以可溶形式表达于BL21(DE3)细胞中;SUMO-(LfcinB)2的表达量高于SUMO-LfcinB和SUMO-(LfcinB)3.通过SUMO特异性蛋白酶切除SUMO标签,羟胺释放单体,得到纯化的重组LfcinB,产率约为15 mg/L.生物活性结果表明,重组LfcinB具有一定的抗菌和抗肿瘤活性.本研究为结合SUMO标签与串联表达策略大量制备获得具有生物学功能的重组抗菌肽提供了一种有效的方法.

牛源防御素类抗菌肽的生物信息学分析

为研究牛源防御素类抗菌肽的生物学功能,本研究利用Prot Param工具分析了抗菌肽的理化性质,利用SOPMA分析了抗菌肽的二级结构,利用NetOGlyc 4.0 Server分析了抗菌肽的糖基化,利用NetPhos 3.1 Server分析了抗菌肽的磷酸化,利用Target P 1.1 Server分析了抗菌肽的亚细胞内定位。结果表明,牛源防御素类抗菌肽为阳离子型抗菌肽,等电点在9.31~11.20之间;TAP、bBD-1、BNBD2、BNBD3、BNBD7、BNBD8和BNBD9为稳定性多肽,其他牛源防御素类抗菌肽为不稳定多肽;BNBD12和BNBD13为疏水性多肽,其他牛源防御素类抗菌肽为亲水性多肽;TAP、LAP、b BD-1、BNBD2、BNBD3、BNBD4、BNBD6、BNBD7、BNBD8和BNBD10由α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲构成,EBD、BNBD1、BNBD5、BNBD11、BNBD12和BNBD13由β折叠、β转角和无规则卷曲构成;没有糖基化位点,除了BNBD7不存在磷酸化位点外,其他16种防御素类抗菌肽存在丝氨酸和苏氨酸的磷酸化位点,但不存在酪氨酸的磷酸化位点。根据分析结果推测牛源防御素类抗菌肽可作用于细胞壁或细胞膜,从而导致细菌死亡。

牛乳铁素优势肽Lfcin B_(1-10)的生物信息学分析

牛乳铁素(Bovine lactoferricin,Lfcin B)是牛乳铁蛋白经胰酶消化后释放出的17位至41位氨基酸残基构成的短肽,具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤和抗寄生虫等生物活性。为了深入开发和利用Lfcin B,进一步去除Lfcin B的部分C-末端氨基酸残基,形成了由10个氨基酸残基构成的短肽,称为Lfcin B_(1-10)。Lfcin B1-10较好地保留了Lfcin B的生物活性,但有关Lfcin B_(1-10)的理化性质、结构、跨膜区等是否改变尚不清楚。因此,利用生物信息学方法对Lfcin B_(1-10)的氨基酸的理化性质、二级结构、跨膜区、信号肽及酶切位点等特征进行预测分析。结果显示,Lfcin B_(1-10)为阳离子型抗菌肽,理论等电点为11.71,热稳定性较差;分子为亲水性寡肽,二级结构仅有无规则卷曲,无跨膜区和信号肽,可被机体内多种酶降解,具有良好安全性。研究不仅为深入认识其构效关系、抗菌机制提供依据,同时为Lfcin B1-10的实际应用提供参考。

3种检测牛白细胞源抗菌肽抗病毒活性方法的建立

为了建立牛白细胞源抗菌肽抗病毒活性的检测方法,采用半数组织细胞感染量(TCID_(50))测定、荧光试验、MTT比色3种方法,用Vero ccl-81作为细胞模型,以猪水疱性口炎病毒(VSV)作为模式病毒,对牛白细胞源抗菌肽抗病毒活性进行评价。依据3种方法浓度水平测定的结果和由此结果推算出的抗病毒指标值建立回归模型,并对3种方法的稳定性进行试验。结果表明:抗菌肽浓度在0～62.5μg/mL时对Vero ccl-81细胞安全,在此浓度区间检测方法有效。在3种检测方法中,TCID_(50)法最准确,荧光试验特异直观迅速,MTT比色法准确又直观。TCID_(50)方法回归模型方程为:y=0.285x+1.890(R^2=0.928),荧光试验回归模型方程为:y=2.138x+6.136(R^2=0.903),CPE法回归模型方程为:y=10.229x+3.859(R^2=0.979),3种方法稳定性均较好。说明牛白细胞源抗菌肽基于TCID_(50)法、荧光试验、MTT比色法3种方法联合检测模型可以定量化地准确计算其抗病毒活性。