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Correlation between the Insertion/Deletion Mutations of Prion Protein Gene and BSE Susceptibility and Milk Performance in Dairy Cows 被引量:1
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作者 Shen-rong Hu Yong-tao Huai +3 位作者 Chuan-ying Pan Chu-zhao Lei Hong Chen Xian-yong Lan 《国际感染病学(电子版)》 CAS 2013年第4期153-162,共10页
Objective To investigate the 23 bp and 12 bp insertion/deletion(indel)mutations within the bovine prion protein(PRNP)gene in Chinese dairy cows,and to detect the associations of two indel mutations with BSE susceptibi... Objective To investigate the 23 bp and 12 bp insertion/deletion(indel)mutations within the bovine prion protein(PRNP)gene in Chinese dairy cows,and to detect the associations of two indel mutations with BSE susceptibility and milk performance.Methods Based on bovine PRNP gene sequence,two pairs of primers for testing the 23 bp and 12 bp indel mutations were designed.The PCR amplification and agarose electrophoresis were carried out to distinguish the different genotypes within the mutations.Moreover,based on previous data from other cattle breeds and present genotypic and allelic frequencies of two indels mutations in this study,the corrections between the two indel mutations and BSE susceptibility were tested,as well as the relationships between the mutations and milk performance traits were analyzed in this study based on the statistical analyses.Results In the analyzed Chinese Holstein population,the frequencies of two"del"alleles in 23 bp and 12 bp indel muations were more frequent.The frequency of haplotype of 23del-12del was higher than those of 23del-12ins and 23ins-12del.From the estimated r2and D’values,two indel polymorphisms were linked strongly in the Holstein population(D’=57.5%,r2=0.257).Compared with the BSE-affected cattle populations from the reported data,the significant differences of genotypic and allelic frequencies were found among present Holstein and some BSE-affected populations(P<0.05 or P<0.01).Similarly,there were significant frequency distribution differences of genotypes and alleles among Chinese Holstein and several previous reported healthy dairy cattle(P<0.05 or P<0.01).Moreover,association of genotype and combined genotypes of two indel polymorphisms with milk performance and resistant mastitis traits were analyzed in Holstein population,but no significant differences were found(P>0.05).Conclusions These observations revealed that the influence of two indel mutations within the bovine PRNP gene on BSE depended on the breed and they did not affect the milk production traits,which layed the foundation for future selection of resistant animals,and for improving health conditions for dairy breeding against BSE in China. 展开更多
关键词 Dairy cows Prion protein(PRNP) gene bovine spongiform encephalopathy(BSE) Insertion/deletion(indel) mutation association Milk performance
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母牛早期妊娠诊断技术研究进展 被引量:2
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作者 原开敏 时玉新 +4 位作者 董智豪 赵羚均 许师源 吴开慧 王栋 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2223-2230,共8页
简单、准确的早期妊娠诊断,是减少空怀,提升母畜繁殖力、提高养殖场经济效益的重要手段。直肠触诊、B超检查、孕酮检测等传统妊娠诊断方法,虽然为养殖生产提供了重要技术支撑,但还未实现母牛配后最早检测,部分养殖场还难以满足较高的技... 简单、准确的早期妊娠诊断,是减少空怀,提升母畜繁殖力、提高养殖场经济效益的重要手段。直肠触诊、B超检查、孕酮检测等传统妊娠诊断方法,虽然为养殖生产提供了重要技术支撑,但还未实现母牛配后最早检测,部分养殖场还难以满足较高的技术要求或实验室条件。胚胎滋养层细胞分泌的妊娠相关蛋白(PAGs)是奶牛妊娠过程中的重要蛋白,其血液含量变化规律为妊娠诊断方法研发提供了新思路。本文简要概述了现有妊娠诊断方法,详细论述PAGs诊断方法发展历程,展望未来妊娠诊断技术发展方向,使其在“早”、“准”、“简便性”上取得重要进展,并为相关研究提供了重要参考。 展开更多
关键词 早期妊娠诊断 牛妊娠相关蛋白 自动化 中红外光谱
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牛妊娠相关糖蛋白1(bPAG1)的真核表达及纯化 被引量:7
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作者 刘长彬 卢春霞 +2 位作者 杨华 张云生 石国庆 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第8期1944-1949,共6页
[目的]本研究旨在构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞细胞中转染表达。[方法]通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG1的全基因序列,经T4连接酶将载体PCDNA3.1(-)与酶切bPAG1片段连接,构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组载... [目的]本研究旨在构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞细胞中转染表达。[方法]通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG1的全基因序列,经T4连接酶将载体PCDNA3.1(-)与酶切bPAG1片段连接,构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组载体后转染到CHO细胞,经SDS-PAGE和Western Blot检测重组牛妊娠相关糖蛋白1(rbPAG1)的表达效果。[结果]PCR扩增得到1218 bp的bPAG1基因片段,构建的重组质粒PCDNA3.1(-)-bPAG1经双酶切获得约5400和1218 bp的2条片段,与预期相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致;SDS-PAGE和Western Blot鉴定显示,获得相对分子质量约为62 kDa的bPAG1重组蛋白,通过Ni柱亲和层析纯化后,rbPAG1纯度可达88%。[结论]本研究为bPAG抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 牛妊娠相关糖蛋白 重组蛋白 真核表达 PCDNA3.1(-)
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牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的真核表达及纯化 被引量:11
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作者 刘长彬 石国庆 卢春霞 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1552-1559,共8页
【目的】构建proEM-bPAG9重组表达载体,并在HEK293细胞中转染表达。为进一步抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研究奠定基础。【方法】通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体proEM中,构建proEM... 【目的】构建proEM-bPAG9重组表达载体,并在HEK293细胞中转染表达。为进一步抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研究奠定基础。【方法】通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体proEM中,构建proEM-bPAG9重组载体后转到DH5α感受态细胞中,重组质粒转染至哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达,再通过亲和层析纯化bPAG9重组蛋白(rbPAG9),经SDS-PAGE和Western Blot检测rbPAG的表达效果。【结果】通过全基因合成法得到1 182 bp的bPAG9基因片段,构建的重组质粒proEM-bPAG9经双酶切获得约4 369 bp和1 176 bp的两条片段,与预期值相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致,氨基酸未发生突变;SDS-PAGE和Western Blot鉴定显示,获得相对分子质量约为68 kDa的bPAG9重组蛋白,通过Ni2+亲和层析纯化后,rbPAG9纯度可达90%。【结论】通过基因优化及真核表达获得分子质量为68 kDa的rbPAG9重组蛋白。 展开更多
关键词 牛妊娠相关糖蛋白 重组蛋白 真核表达
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牛支原体脂质相关膜蛋白诱导胎牛肺细胞差异表达的转录组学研究 被引量:3
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作者 王显兵 汪洋 +8 位作者 李媛 邵家日 王琪 陈莹 周长平 于艳超 王莉莉 辛九庆 马红霞 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期267-271,共5页
为阐明牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导胎牛肺(EBL)细胞的免疫应答机制,本研究采用转录组测序(RNA-seq)技术结合生物信息学方法分析M.bovis LAMPs诱导EBL细胞产生的差异表达基因。本实验首先分别构建LAMP... 为阐明牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导胎牛肺(EBL)细胞的免疫应答机制,本研究采用转录组测序(RNA-seq)技术结合生物信息学方法分析M.bovis LAMPs诱导EBL细胞产生的差异表达基因。本实验首先分别构建LAMPs诱导组与对照组EBL细胞的c DNA文库并对其进行高通量测序,利用MAS3.0软件对差异表达基因进行筛选,结果显示共筛选得到706个差异表达基因,其中上调和下调差异基因分别为364个和342个;GO注释显示,差异表达基因编码蛋白主要与细胞黏附、免疫应答以及细胞增殖等相关;利用荧光定量PCR对部分差异表达基因(PIM2、F2RL1以及PTPN2)的表达情况进行验证,结果与RNA-seq测序结果相符。本研究为进一步阐述M.bovis的致病机制及宿主的免疫应答机制提供依据。 展开更多
关键词 牛支原体脂质相关膜蛋白 胎牛肺细胞细胞 转录组测序
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牛支原体及其脂质相关膜蛋白诱导胎牛肺细胞IL-1β表达的分子机制研究 被引量:3
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作者 刘素丽 汪洋 +6 位作者 李媛 周玉梅 高利萍 邵佳日 王琪 陈莹 辛九庆 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期444-447,共4页
为研究牛支原体(M.bovis)及其脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导胎牛肺(EBL)细胞IL-1β表达的分子机制,本研究首先以M.bovis及其LAMPs刺激EBL细胞,利用荧光定量PCR检测细胞因子IL-1β的动态变化;然后将融合表达的细胞p65(Rel A)蛋白和绿色荧光... 为研究牛支原体(M.bovis)及其脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导胎牛肺(EBL)细胞IL-1β表达的分子机制,本研究首先以M.bovis及其LAMPs刺激EBL细胞,利用荧光定量PCR检测细胞因子IL-1β的动态变化;然后将融合表达的细胞p65(Rel A)蛋白和绿色荧光蛋白重组质粒p EGFP-p65转染EBL细胞,以LAMPs刺激EBL细胞,通过激光共聚焦观察p65的亚细胞分布。荧光定量PCR结果显示,M.bovis及其LAMPs能够诱导EBL细胞IL-1β的表达;而且LAMPs作用的最佳剂量为2μg/m L,最佳时间为12 h。同时,激光共聚焦试验检测到LAMPs能够诱导p65进入EBL细胞核中。上述实验结果表明LAMPs能够诱导EBL细胞中p65进入细胞核内,从而激活NF-κB信号通路,诱导IL-1β上调表达。 展开更多
关键词 牛支原体 脂质相关膜蛋白 胎牛肺细胞 NF-κB信号通路 IL-1Β IL-1Β
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基于密码子优化策略的牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的原核表达及纯化 被引量:8
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作者 卢春霞 刘长彬 +1 位作者 石国庆 杨华 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第1期122-129,共8页
为了构建pET30a-bPAG9重组表达载体,并在BL21(DE3)感受态细胞中转染高效表达牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9),通过生物信息学技术对bPAG9基因进行密码子优化,人工合成bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体pET30a中。将构建的... 为了构建pET30a-bPAG9重组表达载体,并在BL21(DE3)感受态细胞中转染高效表达牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9),通过生物信息学技术对bPAG9基因进行密码子优化,人工合成bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体pET30a中。将构建的重组质粒pET30a-bPAG9转染至BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,经过超声波裂解和亲和层析方法获得重组蛋白bPAG9。用SDS-PAGE和Western Blot方法检测重组蛋白bPAG9的表达效果。结果显示,PCR扩增得到1128 bp的优化bPAG9基因片段,构建的重组质粒pET30a-bPAG9经双酶切获得约5244 bp和1125 bp的2条片段,与预期值相符;对重组载体测序,测序结果与优化后的基因碱基序列完全一致,编码的氨基酸序列未发生突变;SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果显示,获得相对分子质量约为4.0×10^4的bPAG9重组蛋白,通过亲和层析纯化后,重组蛋白bPAG9纯度到达90%以上。 展开更多
关键词 牛妊娠相关糖蛋白 密码子 重组蛋白 原核表达
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妊娠相关血浆蛋白A定量测定方法的建立 被引量:5
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作者 李灵俊 陈淑莲 +3 位作者 李向东 彭学静 李会强 王学谦 《天津医药》 CAS 北大核心 2010年第5期356-359,共4页
目的:建立人外周血妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)定量酶联免疫测定方法。方法:以生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素间接包被微孔板,将标记有生物素的抗PAPP-A抗体作为捕获抗体,结合标本中的抗原成分;标记有辣根过氧化物酶的抗PAPP-A抗... 目的:建立人外周血妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)定量酶联免疫测定方法。方法:以生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素间接包被微孔板,将标记有生物素的抗PAPP-A抗体作为捕获抗体,结合标本中的抗原成分;标记有辣根过氧化物酶的抗PAPP-A抗体作为检测抗体,经酶催化底物显色,定量测定人体外周血PAPP-A。结果:所建立的测定方法灵敏度为0.31mg/L,回收率均在95%~100%之间;该方法线性、稳定性及特异性良好;3份低、中、高浓度的血清标本重复测定10次,批内变异系数(CV)均小于10%,批间CV均小于15%;该方法测量结果与国外同类方法测量结果具有相关性(r=0.982,P〈0.05),2种检测方法高度相关。结论:本文采用间接包被技术所建立的人外周血PAPP-A固相酶联免疫测定方法灵敏、可靠、稳定性好,与国外同类方法的试剂盒之间相关性较高。 展开更多
关键词 妊娠相关血浆蛋白A 间接包被 酶联免疫吸附测定 血清白蛋白
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高磁场响应性蛋白偶联磁性微球的制备及其在药物-蛋白结合常数测定中的应用
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作者 潘晓霞 《应用化工》 CAS CSCD 2014年第8期1531-1535,共5页
以蛋白偶联磁性微球(MB)为固相基质,通过磁场下快速分离蛋白和上清,高效液相色谱法测定上清中的药物浓度,建立了测定药物与蛋白结合常数(Ka)的新方法。选择对药物非特异性吸附较少和磁响应性较高的四氧化三铁磁性微球为载体,分别以1-(3... 以蛋白偶联磁性微球(MB)为固相基质,通过磁场下快速分离蛋白和上清,高效液相色谱法测定上清中的药物浓度,建立了测定药物与蛋白结合常数(Ka)的新方法。选择对药物非特异性吸附较少和磁响应性较高的四氧化三铁磁性微球为载体,分别以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)及戊二醛作为偶联剂,制备牛血清白蛋白(BSA)包覆的磁性微球(MB-BSA),两种偶联方法所得磁性微球的蛋白最大键合量均为50μg/mg。以布洛芬为模型药物,研究药物在蛋白偶联磁性微球上的吸附行为及药物-蛋白的相互作用模式,优化药物吸附和解吸过程。利用高效液相色谱法测定经磁性分离的上清液中的游离药物浓度,通过罗森塔尔方程计算药物与BSA结合常数。最后将所建立的方法应用到色氨酸、安立生坦、瑞替加滨、罗氟司特等4种不同药物与蛋白的结合常数的测定,获得满意结果。 展开更多
关键词 磁性微球 牛血清白蛋白 药物-蛋白作用 结合常数
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囊泡相关膜蛋白A调控牛病毒性腹泻病毒复制 被引量:2
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作者 史慧君 袁圆圆 +4 位作者 郭妍婷 陈俊贞 杨莉 冉多良 付强 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期635-644,共10页
[背景]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一,而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少,成为限制BVDV防控的重要原因。[目的]探明囊泡相关膜蛋白A(vesicle-associated membrane protein A,VAPA)... [背景]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一,而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少,成为限制BVDV防控的重要原因。[目的]探明囊泡相关膜蛋白A(vesicle-associated membrane protein A,VAPA)对BVDV复制的影响。[方法]根据GenBank中VAPA基因,使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向VAPA的向导RNA(small guide RNA,sgRNA),融合后克隆至慢病毒lentiCRISPR v2载体中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素连续筛选5代,使用Western Blot检测VAPA蛋白敲除(knockout,KO)情况;BVDV感染VAPA KO细胞不同时间后,收集细胞提取总RNA,并将等质量的RNA反转录成cDNA,使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫荧光分析(immunofluorescence assay,IFA)分别检测BVDV 5’-非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA水平和双链RNA(double strand RNA,dsRNA)积累水平,于BVDV感染后不同时间观察致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,并收集子代病毒液,使用Reed-Muench法计算子代病毒滴度变化。接种等量VAPAKO和乱码序列对照scramble细胞后不同时间进行活细胞计数,检测VAPA KO是否影响细胞活性。[结果]慢病毒感染后使用嘌呤霉素筛选,Western Blot检测VAPA蛋白明显降低,成功获得VAPAKO细胞;与对照scramble细胞相比,BVDV感染VAPAKO细胞后5’-UTR mRNA水平和dsRNA积累量均显著性降低,BVDV感染造成的CPE明显推迟并减轻,子代病毒滴度在12 h和36 h显著下降,在48 h极显著下降;与scramble细胞相比,VAPA KO细胞活性未受影响。[结论]VAPAKO后显著性抑制BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供重要靶标。 展开更多
关键词 囊泡相关膜蛋白A 牛病毒性腹泻病毒 复制水平 双链RNA 病毒滴度
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牛乳腺炎标志物血清淀粉样蛋白A3的原核表达及其单克隆抗体的制备 被引量:1
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作者 樊一明 刘鑫楠 +4 位作者 魏治静 包永占 董维亚 张小兵 吴萌 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期395-402,共8页
为了表达牛乳腺相关血清淀粉样蛋白A3(M-SAA3)基因,获得其重组蛋白及单克隆抗体(MAb),本研究将编码M-SAA3的基因片段经密码子优化后接入载体pET-30a(+)中,然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。以镍柱纯化蛋白后,免疫BALB/c... 为了表达牛乳腺相关血清淀粉样蛋白A3(M-SAA3)基因,获得其重组蛋白及单克隆抗体(MAb),本研究将编码M-SAA3的基因片段经密码子优化后接入载体pET-30a(+)中,然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。以镍柱纯化蛋白后,免疫BALB/c小鼠制备M-SAA3 MAb。结果显示,扩增的M-SAA3基因序列无误;M-SAA3基因成功转入表达载体;菌液的诱导表达D600值=0.8为最优条件;重组蛋白纯度可达98%,浓度为1.146 mg/m L;制得7株MAb效价均>1∶1600,亚型均为Ig G3,研制的3B2B4 MAb可分别与M-SAA3的重组及天然蛋白特异性结合。该成果为将来针对M-SAA3的奶牛乳腺炎检测产品研发提供了重要原料。 展开更多
关键词 牛血清淀粉样蛋白A3(M-SAA3) 乳腺炎 原核表达 单克隆抗体(MAb)
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