MSTN^(-/-)鲁西黄牛肌肉全转录组共表达网络及转录本富集分析

为了探究与牛骨骼肌发育相关的共表达网络及核心转录本,挖掘牛骨骼肌在发育过程中的调控转录本,试验采用新的fastp+kallisto+Sleuth分析方法对牛骨骼肌转录组测序数据进行分析,通过转录组测序分析筛选出两组肌肉样本差异表达的RNA,对其进行GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析、WGCNA分析和GSEA富集分析。结果表明:转录组测序共鉴定出32919个转录本,按照是否满足|lbFC|≥2、P<0.05的条件共筛选出457个差异表达转录本,其中上调转录本303个,下调转录本154个。457个差异表达转录本共涉及106个GO功能注释条目和14个KEGG信号通路,差异表达转录本主要富集在与细胞周期、细胞生长密切相关的基因功能注释和信号通路中。457个差异表达转录本被划分到显著相关的3个转录本模块,棕色模块有83个转录本,蓝色模块有93个转录本,绿色模块有111个转录本,并且筛选出10个核心转录本。核心转录本多数集中在细胞黏附分子、AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调节等与细胞周期、细胞生长密切相关的通路中。说明牛骨骼肌发育受基因转录水平调控的影响。

EGR1基因在牛骨骼肌卫星细胞分化不同时期的表达及定位

目的:研究EGR1基因在牛骨骼肌卫星细胞(MDSCs)分化过程的表达、定位及入核机制。方法:以牛的MDSCs为实验材料,在分化培养基中分别分化培养1 d、3 d和5 d,每组3个重复,检测不同分化时间的MDSCs中EGR1基因的表达和EGR1蛋白的定位情况;采用CRISPRi方法干扰内源EGR1的表达,结合定点突变和激光共聚焦方法初步探索了EGR1蛋白入核的机制。结果:qRT-PCR和Western blot检测结果显示随着分化时间的进行,EGR1基因在转录水平和蛋白水平的表达都显著高于未分化的细胞,并随时间的延长而表达逐渐升高,分化第3日时表达量最高,随后开始下降。免疫荧光检测到EGR1蛋白主要在分化的MDSCs中表达,并随肌管数量增多而表达量增加。共聚焦结果显示随着细胞分化的进行,部分EGR1蛋白转移进入细胞核。定点突变EGR1蛋白S533A后,分化的MDSCs细胞核内没有检测到EGR1蛋白。结论:在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中,EGR1基因转录表达水平升高,部分EGR1蛋白转移入细胞核,且EGR1蛋白C端第533位丝氨酸磷酸化是入核所必需的。

秦川牛胎儿骨骼肌卫星细胞的分离培养

【目的】探索胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、鉴定及基因转染的方法。【方法】分别采用Ⅰ型胶原酶消化、Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化及链霉蛋白酶消化法对胎牛骨骼肌卫星细胞进行培养,比较了3种不同分离方法所得细胞数及其存活率的差异;利用差速贴壁法和Percoll密度梯度离心相结合的方法纯化骨骼肌卫星细胞,对纯化后的细胞进行myostatin基因RT-PCR以及结蛋白(Desmin)免疫细胞化学染色鉴定,最后通过电转染法对纯化的骨骼肌卫星细胞进行EGFP基因转染研究。【结果】3种消化培养方法中,以链霉蛋白酶消化法分离得到的胎牛骨骼肌卫星细胞数显著高于其它2种方法(P<0.05),但细胞存活率较低(P<0.05);而采用Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化法可以得到相对较高的细胞数及存活率。利用差速贴壁和Percoll密度梯度离心相结合的方法可以得到纯化的骨骼肌卫星细胞;电转染法适用于骨骼肌卫星细胞的基因转染。【结论】建立了胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、纯化、鉴定及基因转染的方法,为通过转基因方法改良秦川牛产肉性能研究奠定了基础。

mir-133b对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

为了探讨mir-133b对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响,试验将分离培养的牛骨骼肌卫星细胞接种在6孔板中,待细胞汇合度为70%时,用Lipofectamine 2000转染mir-133b的过表达载体进入牛骨骼肌卫星细胞,48 h后实时定量检测RNA表达水平,并用EDU试剂盒检测细胞增殖状况,实时定量PCR检测mir-133b的靶基因sp1的RNA表达情况。结果表明:在牛骨骼肌卫星细胞中,作EDU增殖过表达mir-133b以后细胞增殖数量显著增多。说明mir-133b对牛骨骼肌卫星细胞增殖具有促进作用。

miR-181a对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响

为了探讨miR-181a对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响,试验将分离培养的牛骨骼肌卫星细胞接种在6孔板中,待细胞汇合度为70%时,用PEI转染miR-181a的模拟物miR-181a-M、抑制剂miR-181a-I、模拟物对照miR-181a-M-NC和抑制剂对照miR-181a-I-NC进入牛骨骼肌卫星细胞中,在0,1,2,3天用Western-blot检测肌肉有关分化蛋白MyoD、MyoG和MYH3以及靶基因HOX-A11蛋白的表达量,用免疫荧光法检测细胞肌管的数量。结果表明:在牛骨骼肌卫星细胞中,转染miR-181a模拟物的牛骨骼肌卫星细胞,有关肌肉分化蛋白质如MyoD、MyoG和MYH3的表达量明显增加,细胞肌管数量显著增多,进一步证实miR-181a促进细胞的分化。在双荧光素酶报告系统中,miRNA-181a和HOX-A11基因的3'-UTR结合时荧光素酶活性明显下降,miRNA-181a和突变的3'-UTR结合时荧光素酶活性没有下降。说明HOX-A11是miR-181a的靶基因,miR-181a对牛骨骼肌卫星细胞的分化具有促进作用。

干扰lnc23后牛骨骼肌卫星细胞转录组测序的生物信息学分析

试验旨在分析lnc23在调控牛骨骼肌卫星细胞分化过程中转录组水平的变化,筛选出可能参与调节骨骼肌卫星细胞生长的调控通路及相关mRNAs。采用第二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)基于Illumia hiSeq测序平台对成功构建的lnc23抑制模型及相应对照组的牛骨骼肌卫星细胞进行转录组测序,将数据整理、过滤及评估后,通过生物信息学方法分析样品间基因转录差异表达,对这些差异基因进行GO和KEGG富集分析,并应用实时荧光定量PCR技术对转录组数据结果进行验证。结果显示,转录组测序共鉴定到19358个基因,筛选到1297个差异表达基因,其中上调856个,下调441个。差异基因的GO功能分析共包括细胞组分、分子功能和生物学过程3大类222个分支,其中有大量的差异基因与催化活性、分子功能调节、信号转导、生物黏附、新陈代谢相关。KEGG分析显示,差异基因共涉及190个通路,显著富集在PI3K-Akt、P53、TNF、RIG-Ⅰ样受体、神经活性配体受体互作、细胞因子互作等信号通路上,进一步从中筛选出可能参与细胞生长、肌肉发育过程的差异基因,如CCNA 2、RRM 2、IL-6、MYL 2等。实时荧光定量PCR结果显示,所选的11个差异基因中有9个与转录组测序结果变化一致,表明了测序结果的可靠性。本试验完成了干扰lnc23及其对照后牛骨骼肌卫星细胞的转录组测序分析,获取差异基因的功能注释信息,初步揭示lnc23调控牛骨骼肌卫星细胞分化的潜在基因和通路,为深入探究lnc23调控牛骨骼肌卫星细胞的分化机制打下良好的基础。

HOXA10基因对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

该文探讨了HOXA10基因对牛骨骼肌卫星细胞(bovine skeletal muscle satellite cells,BSMSCs)增殖分化的作用。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测增殖1、2、3天(P1、P2、P3)BSMSCs中HOXA10、PCNA基因的表达情况;将HOXA10基因过表达质粒、干扰质粒及对照质粒转染至BSMSCs中,利用qRT-PCR、蛋白质免疫印迹(Western blot)实验检测过表达及干扰效果;采用CCK-8、EdU、流式细胞术(Flow CytoMetry,FCM)、免疫荧光、qRT-PCR和Western blot检测细胞活力、细胞增殖、细胞周期、细胞分化以及细胞增殖和分化标志基因的mRNA及蛋白表达情况。结果显示,在BSMSCs增殖过程中HOXA10 mRNA水平显著升高(P<0.01,P<0.001);与对照组相比,转染24 h后过表达及干扰效果显著(P<0.01,P<0.001);过表达HOXA10基因后细胞活力增强,EdU阳性细胞比例显著增多(P<0.001),G1期细胞百分比显著降低(P<0.01),S期细胞百分比显著增加(P<0.05),增殖标志基因PCNA、CCND1 mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01);肌管形成水平显著降低,分化标志基因MyoG的mRNA和蛋白表达量显著减少(P<0.01,P<0.001)。与对照组相比,干扰HOXA10基因后细胞活力降低,EdU阳性细胞比例显著减少(P<0.05),G1期细胞百分比显著升高(P<0.001),S期细胞百分比显著下降(P<0.01),增殖标志基因PCNA、CCND1mRNA和蛋白的表达水平显著降低(P<0.05,P<0.001);肌管形成水平显著上升,分化标志基因MyoG的mRNA和蛋白表达量显著减少(P<0.001)。综上,HOXA10基因促进BSMSCs增殖,抑制其分化。